不同昆虫寄主对昆虫病原线虫共生菌的敏感性比较

用菜青虫、棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、粘虫、黄粉虫等 6种昆虫对 1 0株昆虫病原线虫共生菌进行了敏感性测定。结果表明 :供试菌株对 6种昆虫都有胃毒活性 ,不同菌株对同一种昆虫的毒力差别较大 ,同一菌株对不同昆虫差别也很大。 1 0株菌在 1 2 0h对菜青虫的校正死亡率和体重抑制率均最高 ,显然是最敏感的寄主。在 1 0株共生菌中 ,XenorhabdusnematophilaHB3 1 0 5 9菌株的胃毒活性最高。     

棉花抗虫工程菌对棉铃虫的离体及活体生物测定

棉花抗虫工程菌是以能在棉株体内定殖的优势内生细菌Bacillus cereus (Bc9102)为宿主菌,将Bt kurstaki的δ-内毒素基因cryIA©整合到其染色体上形成的内生工程菌。以棉铃虫Helicoverpa armigera为供试昆虫的离体生测结果表明：在同一剂量水平上,HE-1、HE-2、ME14-2、ME14-3、MK14-1等工程菌株对棉铃虫幼虫的毒力高于或等于Bt野生菌株HD-73,浓度最高时这几个工程菌处理的棉铃虫死亡率分别为96.7%、83.3%、93.3%、83.3%、80.0%,而HD-73为80.0%,死亡率与浓度呈正相关。在用上述工程菌接种棉花的活体生测中,注射处理和喷雾处理法杀虫效果均优于浸种处理法。以HE-1为例,注射、喷雾、浸种处理4周后棉铃虫校正死亡率分别达到90.0%、76.0%和23.3%。工程菌对棉铃虫的生长发育也有抑制作用。     

玉米内生杀虫工程菌对玉米螟的离体及活体生物测定

12#Bt/CXC是以能定植在玉米维管束系统的内生菌I>Clavibacter xyli subsp.Cynodon—tis(CXC)为宿主菌,将Bt urstaki的δ—内毒素基因cryIA?整合到其染色体上形成的内生工程菌。以玉米螟Ostrinia furnacalis Guenee为供试昆虫的生测结果表明：在同一浓度下,12^#菌株对玉米螟的毒力均高于野生型Bt菌株HD73和空白对照(最低浓度除外)。浓度最高时12^#处理的死亡率为63%,而m工73为53%,死亡率与浓度呈正相关,相关系数r₁₂^#大于r_HD—73。在用12^#Bt/CXC接种玉米的活体生测中,人工接虫4周后检测,注射接种法效果明显优于种子处理法。不同浓度的注射接种处理,玉米螟幼虫减少率最低70%,最高可达96%,与未处理对照相比差异显著。12#菌剂处理后对玉米螟的生长发育也有抑制作用,虫体重减轻26.4%～44.5%,处理株虫龄平均为2龄,而对照株为4龄。     

粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌的增效特性及对Bt毒蛋白的降解活化作用

以小菜蛾Plutella xylostella为试虫,采用生物测定方法测定了粘虫颗粒体病毒（Pseudaletia unipuncta granulosis virus,PuGV-Ps）对苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）的增效作用。结果表明：不同配伍PuGV-Ps和Bt间的共毒系数在105.3至195.0之间, PuGV-Ps对Bt毒力具有增强作用,其中以Bt∶PuGV-Ps为4∶1增效作用最明显,72 h LC₅₀为0.039 mg/mL。不同温度和pH值都影响PuGV-Ps对Bt的增效作用,16℃～20℃增效程度明显高于24℃～32℃,而碱性条件下（pH 8～9）增效作用更显著。PuGV-Ps对Bt的增效作用因小菜蛾龄期不同而变化,2、3龄幼虫死亡率较单独使用Bt分别提高了50%和30.31%,而作用于低龄（1龄）和高龄（4龄）幼虫时对Bt的增效作用不显著。PuGV-Ps饲喂2 h后再接毒Bt,小菜蛾死亡率明显提高,48 h死亡率达66.67％,较直接饲喂Bt+PuGV-Ps处理死亡率提高了53.87％,差异极显著。SDS-PAGE表明PuGV-Ps具有碱性蛋白酶的活性,离体条件下能促进δ-内毒素酶解为47 kD,60 kD和61 kD的毒性肽。     

杀虫荧光假单胞工程菌的构建及其杀虫效果

以转座子mini-Tn5为介导,用高压电激转化法将BtcryIA©基因整合到生防细菌荧光假单胞菌P303-1的染色体上。通过对重组菌株染色体DNA酶切分析、PCR检测,表明转化子DNA中含有cryIA©基因及其营养期表达的强启动子。SDS-PAGE鉴定、ELISA检测及电镜观察证实了杀虫晶体蛋白在P303-1中的高效表达。生物测定结果显示工程菌对棉铃虫Helicoverpa armigera具有显著毒杀作用。工程菌PT45、PT51、PT61、PT71和野生菌HD-73对棉铃虫2龄幼虫5天的LC₅₀值分别为50.1281 μg/g、71.7763 μg/g、69.0820 μg/g、57.9895 μg/g、192.8747 μg/g。死亡率与浓度呈正相关,体重与浓度呈负相关。     

豆薯种子中的杀虫成分及其毒力测定

为明确豆薯Pachyrrhizus erosus (L.) Urban种子中的杀虫成分及其杀虫毒力,以白纹伊蚊Aedes albopictus 4龄幼虫为目标昆虫,在活性跟踪的基础上,通过多种色谱技术和核磁共振技术分离鉴定其化学成分结构,并通过浸渍法、点滴、夹毒叶碟法等测定各化合物对白纹伊蚊幼虫、棉蚜Aphis gossypii无翅成蚜、甘薯天蛾Herse convolvuli幼虫和小菜蛾Plutella xylostella幼虫的杀虫活性和作用方式。结果表明,从豆薯种子中共分离、鉴定了14个化合物,即12a-hydoxyrotenone,pachyrrhizine,12a-hydoxypachyrrhizone,12α-dehydropachyrrizone,α-naphthoflavone,7-methoxyflavanone,12α-hydroxydolineone,6-methoxyflavone,4′-hydoxyflavanone,quercetin dihydate,5-methoxyflavone,7-hydroxyflavone,3′-hydoxyflavanone和3-hydroxyflavone。上述化合物中的前7个化合物对白纹伊蚊4龄幼虫具有毒杀活性, 处理24 h的LC₅₀分别是25.0,51.1,196.2,48.4,98.9,107.2 和15.6 mg/L;前6个化合物对棉蚜成虫24 h 的毒力分别为1.5,10.9,80.7,8,32.1和112.8 mg/L;前5个化合物以及12α-hydroxydolineone对甘薯天蛾3龄幼虫有毒杀活性;12α-hydoxyrotenone对3龄小菜蛾幼虫24 h的胃毒毒力LD₅₀为17.3 μg/头,7-methoxyflavanone对该虫仅表现出较弱的生长发育抑制活性。首次从豆薯种子中分离得9个化合物,即6-methoxyflavone,4′-hydoxyflavanone,quercetin dihydate,α-naphthoflavone,7-methoxyflavanone,5-methoxyflavone,7-hydroxyflavone,3′-hydoxyflavanone和3-hydroxyflavone;豆薯种子含有7个活性成分,其作用方式因目标昆虫不同而不同,其主要杀虫成分不是鱼藤酮而是12α-羟基鱼藤酮。     

球形芽孢杆菌对致倦库蚊的后致死作用

研究了球形芽孢杆菌Bacillus sphaericus C3-41菌株对致倦库蚊Culex quinquefasciatus幼虫的毒力及其后致死作用。生物测定表明,该菌株对目标蚊幼虫具有很高的毒力,其丙酮粉剂对3～4龄幼虫48 h的半致死浓度(LC₅₀)为(6.92±0.22) μg/L。用不同亚致死浓度处理2～3龄致倦库蚊幼虫,存活幼虫在后期发育中存在明显的延续死亡和损伤现象,经LC₃₀、LC₅₀、LC₇₀、LC₉₀和LC₉₈剂量的C3.41粉剂处理的致倦库蚊羽化前的总死亡率分别为84%、91%、95%、97%和100%,同时存活的幼虫、蛹和成蚊的发育和行为也受到一定的影响。这种后致死作用随处理浓度的升高而增强,可能同球形芽孢杆菌毒素蛋白对处理期间蚊幼虫中肠上皮细胞造成的损伤相关。     

Interruptin B对小菜蛾和亚洲玉米螟幼虫的拒食活性及对斜纹夜蛾卵巢细胞的毒力

为了研究Interruptin B的杀虫活性, 初步探讨其杀虫作用机理, 本研究采用叶碟法和叶片浸渍法测定了Interruptin B对小菜蛾Plutella xylostella和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 3龄幼虫的拒食活性和毒杀活性; 采用注射法和血球计数法研究对斜纹夜蛾Spodoptera litura幼虫血细胞数的影响; 采用四甲基偶氮唑盐［3-(4, 5-dimethylthiazole-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT］法测定对斜纹夜蛾卵巢细胞(SL细胞)的增殖抑制作用; 采用倒置显微镜观察对SL细胞形态、密度和贴壁率的影响。结果显示：处理后48 h, Interruptin B对亚洲玉米螟和小菜蛾3龄幼虫的拒食中浓度(AFC₅₀）分别为108.56 和143.88 μg/mL, 致死中浓度(LC₅₀）分别为346.23和194.32 g/mL; 处理后24 h和48 h, 对SL细胞的抑制中浓度(IC₅₀）分别为13.51和4.11 g/mL。Interruptin B处理SL细胞后12-48 h, 细胞密度随时间的延长而下降, 与对照差异显著(P<0.05）; 处理后3, 6, 12, 24和48 h, SL细胞变形率分别为28.18%, 83.90%, 85.18%, 93.93%和100%, 细胞贴壁率分别为96.59%, 89.90%, 83.18%, 5.06%和1.09% , 处理后6-48 h, SL细胞变形率和贴壁率与对照差异显著(P<0.05）。Interruptin B对小菜蛾和亚洲玉米螟3龄幼虫具有良好的拒食和毒杀活性, 能显著降低斜纹蛾幼虫血细胞数量, 对SL细胞具有良好的增殖抑制作用, 可显著降低SL细胞生长密度, 改变细胞形态, 降低贴壁率, 表明该化合物可通过影响昆虫细胞活力毒杀活体昆虫。     

嗜线虫致病杆菌HB310菌株杀虫蛋白的纯化及活性鉴定

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310是从河北省土壤中筛选出的一株昆虫病原线虫体内分离纯化获得的共生菌,该菌的发酵液对多种昆虫有较高的杀虫活性。利用85％饱和度的硫酸铵盐析分别获得胞内蛋白提取物和上清液中胞外蛋白提取物,生测结果表明这两种蛋白提取物中都含有胃毒素和血腔毒素。通过制备型非变性凝胶电泳对蛋白提取物进行分离和纯化,得到了3种有杀虫活性的毒素蛋白（毒素Ⅰ、毒素Ⅱ和毒素Ⅲ）,胞内的毒素蛋白与分泌到胞外上清液中的毒素蛋白是同种蛋白。毒素Ⅰ和毒素Ⅱ对棉铃虫初孵幼虫有明显的胃毒活性,但没有血腔毒性;毒素Ⅲ对大蜡螟幼虫有很强的血腔毒性,LD₅₀为0.18 μg/头。SDS-PAGE图谱显示毒素Ⅰ和毒素Ⅱ是由多个多肽组成的复合蛋白,而毒素Ⅲ只分离出一条多肽。毒素Ⅱ在50℃处理10 min,其杀虫活性没有显著变化;70℃处理10 min对毒素Ⅲ杀虫活性没有显著影响。     

异小杆线虫XJZL1409(Heterorhabditis bacteriophora)共生菌的分离及致病性研究

本研究分离了来自新疆和田地区间作绿豆的4年枣0-40 cm根际土壤中的昆虫病原线虫XJZL1409Heterorhabditis bacteriophora的共生菌,并进行致病性测定。通过侵染期线虫和线虫致死的大蜡螟幼虫血腔直接分离,采用传统形态学观察结合分子生物学方法对菌株进行鉴定。同时大蜡螟Galleria mellonella 5龄幼虫接种菌株细胞发酵液测定致病性。菌株形态学特性结合16S r DNA序列系统发育分析,线虫XJZL1409的共生菌被鉴定为发光杆菌属Photorhabdus luminescens subsp. laumondii。室内菌液注射毒性测定结果显示,侵染致死的幼虫体色呈灰绿色;接种48 h后,每头幼虫接种菌液量为500 CFU时校正死亡率就可以达到100%; 48 h时致死中浓度LC50为10. 74 CFU/m L。同时菌液口服杀虫毒性结果表明,第5天时待测菌株菌液对大蜡螟幼虫的校正死亡率为21. 21%,体重抑制率为20. 02%。因此,昆虫病原线虫XJZL1409的共生菌为P. luminescens subsp. laumondii对大蜡螟幼虫具有很强的注射毒性,为研究线虫的致病机制及发掘新抗性基因奠定基础。     

Bt杀虫蛋白对不同品系棉铃虫和中红侧沟茧蜂生长发育的影响

以棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)室内敏感品系和田间品系为寄主,研究了亚致死浓度的Bt杀虫蛋白对中红侧沟茧蜂Microplitis mediator (Haliday)生长发育的影响。结果表明： 当寄主一直取食,或者在被寄生前12小时开始取食含Bt杀虫蛋白浓度为0,0.5,1.0, 2.0,4.0,8.0 μg/g的饲料时,与对照相比,中红侧沟茧蜂的卵-幼虫历期延长,茧重和成虫体重降低,成虫寿命缩短,但对茧期没有明显影响。Bt杀虫蛋白能有效抑制两个棉铃虫品系幼虫的生长,显著降低棉铃虫蛹重;当Bt蛋白浓度为4.0 μg/g时,显著降低棉铃虫化蛹率。用转双基因抗虫棉SGK321（表达Cry1A+CpTI蛋白）饲喂两个棉铃虫品系初孵幼虫,室内品系的第2、3、4和5天校正死亡率分别为48.5%、87.8%、96.6%和 95.8%,显著高于田间品系（30.9%、59.6%、80.9%及86.1%）。本研究表明,不论是田间品系还是室内品系,棉铃虫取食含Bt杀虫蛋白的饲料后,对中红侧沟茧蜂的生长发育都具有显著的负面作用。     

Helicoverpa armigera cadherin fragment enhances Cry1Ac insecticidal activity by facilitating toxin-oligomer formation

The interaction between Bacillus thuringiensis insecticidal crystal protein Cry1A and cadherin receptors in lepidopteran insects induces toxin oligomerization, which is essential for membrane insertion and mediates Cry1A toxicity. It has been reported that Manduca sexta cadherin fragment CR12-MPED and Anopheles gambiae cadherin fragment CR11-MPED enhance the insecticidal activity of Cry1Ab and Cry4Ba to certain lepidopteran and dipteran larvae species, respectively. This study reports that a Helicoverpa armigera cadherin fragment (HaCad1) containing its toxin binding region, expressed in Escherichia coli, enhanced Cry1Ac activity against H. armigera larvae. A binding assay showed that HaCad1 was able to bind to Cry1Ac in vitro and that this event did not block toxin binding to the brush border membrane microvilli prepared from H. armigera. When the residues ¹⁴²³GVLSLNFQ¹⁴³⁰ were deleted from the fragment, the subsequent mutation peptide lost its ability to bind Cry1Ac and the toxicity enhancement was also significantly reduced. Oligomerization tests showed that HaCad1 facilitates the formation of a 250-kDa oligomer of Cry1Ac-activated toxin in the midgut fluid environment. Oligomer formation was dependent upon the toxin binding to HaCad1, which was also necessary for the HaCad1-mediated enhancement effect. Our discovery reveals a novel strategy to enhance insecticidal activity or to overcome the resistance of insects to B. thuringiensis toxin-based biopesticides and transgenic crops.     

粉纹夜蛾颗粒体病毒增效基因3'端2.5 kb片段在大肠杆菌中的表达

将粉纹夜蛾Trichoplusia ni颗粒体病毒增效基因3'端2.5 kb片段插入pQE-31中构建了重组表达载体pQE/enhancin,转化大肠杆菌M15(pREP₄)在IPTG诱导下成功表达出分子量约为96 kD的融合蛋白并命名为P96。初步纯化的P96显示了明显的增效活性,可提高棉铃虫核型多角体病毒对棉铃虫3龄幼虫感染死亡率27.40%～34.50%,缩短LT₅₀ 1.9天以上。     

棉铃虫对Bt生物农药早期抗性及与转Bt基因棉抗虫性的关系

用饲料感染法建立了棉铃虫Helicoverpa rmigera(Hubmer)敏感品系(SUS1)对Bt生物农药的敏感毒力基线和区分剂量,1995年测定了五省六县棉铃虫初孵幼虫对Bt生物农药的敏感性,结果表明：山东阳谷、河北邯郸、河南新乡、安徽萧县及江苏丰县棉铃虫已产生早期抗性,抗性个体百分率为5%～10%,与敏感品系相比,LC₅₀值稍有增加,但斜率b值明显变小;而江苏东台棉铃虫仍属敏感。这是国内外首次诊测到棉铃虫对Bt生物农药抗性。用棉叶喂饲法测定比较了转Bt基因棉花品系对不同种群棉铃虫的抗虫性效果,结果表明：用早期抗性的阳谷和新乡棉铃虫初孵幼虫接虫5d后平均死亡率较敏感品系下降16%～29%,说明棉铃虫对Bt农药与转Bt生物基因棉花品系间存在交互抗性。还讨论了Bt农药的抗性治理对策。     

苏云金杆菌δ-内毒素、芽孢及苏云金素A对棉铃虫毒性及拒食性的比较

苏云金杆菌库斯塔克变种HD-1的晶体蛋白与芽孢、HD-1无晶体突变株(Cry-)的芽孢以及苏云金素A对棉铃虫Helicoverpa armigera毒性和拒食性的比较研究显示,HD-1晶体蛋白对棉铃虫的杀虫毒力高, 拒食作用强; HD-1芽孢对棉铃虫具有一定的杀虫活性和生长抑制作用, 并有很强的拒食作用; HD-1无晶体突变株(Cry-)芽孢对棉铃虫无毒也无拒食作用;苏云金素A对棉铃虫的生长发育有极显著的抑制作用, 但对棉铃虫无拒食作用,由此证明晶体蛋白是苏云金杆菌杀虫活性和拒食作用的主要来源。苏云金素A与苏云金杆菌芽孢晶体混合物一起使用, 可使棉铃虫的死亡率显著提高。     

不同温、湿度下白僵菌对棉铃虫幼虫的致病力

测试了不同温、湿度下白僵菌Beauveria bassiana对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫的致病力。实验设置了10、15、20、25、30℃ 5个温度水平,用高浓度（1×10<.sup8孢子/mL）、中浓度（1×10⁷孢子/mL）、低浓度（1×10⁶孢子/mL）的白僵菌孢子液分别感染1～4龄的棉铃虫。结果表明：三个浓度处理的棉铃虫在温度为25℃时的致死中时（LT₅₀）最短,死亡速度最快,死亡率最高;高于或低于此温度时,棉铃虫的LT₅₀延长,死亡速度减慢。相对湿度发生变化时,感病棉铃虫死亡速度和死亡率明显不同。相对湿度为95%左右时,棉铃虫死亡速度最快,死亡率最高;相对湿度低于70%时,棉铃虫死亡率显著降低。     

A toxin protein from Xenorhabdus nematophila var. pekingensis and insecticidal activity against larvae of Helicoverpa armigera

Xenorhabdus nematophila var. pekingensis, which is highly virulent for many insects, is a symbiotic bacterium of Steinernema carpocapsae isolated from Beijing soil in China. Previous studies demonstrated that the bacterium had high antifeedant activity against larvae of Helicoverpa armigera, Plutella xylostella and Spodoptera exigua. Herein, we report the purification, molecular cloning and antifeedant activity of an intracellular toxic protein from the bacterium. The purified protein displayed a single band and a relative molecular weight of over 212 kDa determined by SDS-PAGE. We designated the protein as XnAFP2. Peptide segments were obtained by MALDI-TOF and covered 40% of the amino acid sequence of a toxin protein from X. nematophilus PMFI1296. The full cDNA sequence encoding for XnAFP2 (Genbank accession number FJ222606) was amplified from X. nematophlia var. pekingensis and consists of 7575 bp. The gene showed homology with up to 99% identity to the A2 gene from X. nematophila strain BP (GenBank accession number AY282763) and 92% identity to the insecticidal toxin xptA2 gene from X. nematophila PMFI 1296 (GenBank accession number AJ308438). The protein caused a rapid cessation in feeding and reduction in larval weight of H. armigera. When fed to third instar larvae of H. armigera in an artificial diet at 6.0 µg/g (w/w) toxin protein, growth reduction reached 97.9%. The insecticidal protein greatly decreased fourth instar larval weight, lengthened larval stage, and reduced pupation and emergence rates. The antifeedant rate in choice and no-choice leaf disk tests against fifth instar larvae was 78.4 and 87.6% in 24 h, respectively.     

Reduction of Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxicity against Helicoverpa armigera by a soluble toxin-binding cadherin fragment

A cadherin-like protein has been identified as a putative receptor for Bacillus thuringiensis (Bt) Cry1Ac toxin in Helicoverpa armigera and plays a key role in Bt insecticidal action. In this study, we produced a fragment from this H. armigera Cry1Ac toxin-binding cadherin that included the predicted toxin-binding region. Binding of Cry1Ac toxin to this cadherin fragment facilitated the formation of a 250-kDa toxin oligomer. The cadherin fragment was evaluated for its effect on Cry1Ac toxin-binding and toxicity by ligand blotting, binding assays, and bioassays. The results of ligand blotting and binding assays revealed that the binding of Cry1Ac to H. armigera midgut epithelial cells was reduced under denaturing or native conditions in vitro. Bioassay results indicated that toxicities from Cry1Ac protoxin or activated toxin were reduced in vivo by the H. armigera cadherin fragment. The addition of the cadherin fragment had no effect on Cry2Ab toxicity.     

毒死蜱与阿维菌素增效混配制剂对斑潜蝇属害虫的防治效果

通过有机磷杀虫剂毒死蜱与生物源农药阿维菌素混配制剂对美洲斑潜蝇Liriomyza sativae室内毒力实验,测定共毒系数为165～234,处于明显增效范围内。据此确定最佳配比和次佳配比,配制该增效混剂30%渗透型可湿性粉剂-1和-02,在山东防治美洲斑潜蝇幼虫的田间试验表明药效优良。制剂用量50 g/667m²药后3,7,11天,两可湿粉的校正防效分别为90.43%～91.71%和87.09%～90.53%,可湿粉-1用量25 g/667m²防效为85.96%～88.28%,可湿粉-2用量37.5 g/667m²相应校正防效为84.01%～85.38%,两增效混剂防治斑潜蝇速效性和持效性皆佳,成本有所下降,且对南美洲斑潜蝇L. huidobrensis亦有较好防效。使用可湿粉与乳油相比较可减少投放入环境的化学品数量。