Ri质粒介导的DNA转移及诱发甘草毛根再生植株

本文报道了通过三亲交配将PB1121双元中间载体从大肠杆菌C600转移到发根农杆菌R1000(PRiA4b)中,在含Km、Sm的MinA选择平板上获得了转移子,上述转移子菌液用注射法感染甘草胚轴、茎等外植体,在无激素含1mg/mlcb,0.1mg/mlkm的MS培养基上培养,两周后诱发出毛根,切下毛根在同上培养基上6周长出不定芽,继续培养长成再生植株,经检测转化株毛根中存在甘露碱和GUS基因产物,具有Km抗性和激素自主性生长特性,证明Ri质粒不仅可介导GUS基因转移还可诱发毛根再生植株,提供了简化、高效的植物遗传转化系统。     

发根农杆菌Ri质粒rol基因研究进展及在林木改良上的应用

Ri质粒上携带的诱根基因的表达不仅能导致植物被感染部位形成大量的毛根,而且由毛根容易获得再生的转化植株,这些植株可表现出许多能稳定遗传的表型变异,在植物遗传改良中有着广阔的应用前景。20世纪80年代以来,国内外学者对发根农杆菌Ri质粒及其rol基因进行了广泛深入的研究。本文重点综述了农杆碱型发根农杆菌Ri质粒的结构与功能,rol基因的位点与特征,Ri质粒的转化与rol基因的表达对植物生长发育的影响及在林木遗传改良上应用等方面的研究现状,并讨论了Ri质粒rol基因在林木遗传改良应用上存在的问题与应用前景。     

发根农杆菌Ri质粒rol基因研究进展及在林木改良上的应用

Ri质粒上携带的诱根基因的表达不仅能导致植物被感染部位形成大量的毛根,而且由毛根容易获得再生的转化植株,这些植株可表现出许多能稳定遗传的表型变异,在植物遗传改良中有着广阔的应用前景。20世纪80年代以来,国内外学者对发根农杆菌Ri质粒及其rol基因进行了广泛深入的研究。本文重点综述了农杆碱型发根农杆菌Ri质粒的结构与功能,rol基因的位点与特征,Ri质粒的转化与rol基因的表达对植物生长发育的影响及在林木遗传改良上应用等方面的研究现状,并讨论了Ri质粒rol基因在林木遗传改良应用上存在的问题与应用前景。     

沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的耐寒性研究

以紫花苜蓿品种‘中苜2号’为野生型材料,采用农杆菌介导法将沙冬青脱水素基因(dehydrin,AmDHN)导入紫花苜蓿基因组中并获得转基因植株,通过PCR和Southern blot杂交鉴定转基因植株,利用RT-PCR和qRT-PCR检测转基因植株中AmDHN基因及低温胁迫相关基因的表达量,并测定低温胁迫下苜蓿叶片的脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量,从分子水平和生理指标两个层面研究转基因植株的抗寒特性,为进一步获得抗寒性较强的转基因苜蓿新材料提供依据。结果显示:(1)AmDHN基因已整合在转基因苜蓿植株基因组中,而且在不同的转基因株系中AmDHN的表达量也各不相同。(2)低温(4℃)处理后转基因植株中冷胁迫相关基因CBF2、CBF3、ProDH和CAS17的表达量明显高于同期野生对照;CBF2、CBF3和CAS17表达量在冷处理5h后都显著增加并达到最大值,而ProDH表达量在冷处理7d时最高,它们的最高值分别是对照的2.5、4、1.6和3倍左右。(3)苜蓿叶片的Pro和MDA含量均随低温处理时间延长而逐渐增加,转AmDHN基因苜蓿叶片的Pro含量始终高于同期野生型植株,而其MDA含量却始终低于同期野生型植株,且两类植株间差异均在胁迫14d时达到显著水平。因此,推测转AmDHN基因苜蓿中积累的AmDHN蛋白可能对一些酶的活性及膜系统起冷冻保护作用,从而使得转AmDHN基因紫花苜蓿的植株抗寒性提高,同时AmDHN也可能通过调控与低温相关基因的表达间接调节植物的耐低温能力。     

根癌农杆菌介导天花粉蛋白基因TCS转化茎瘤芥的研究

以茎瘤芥(Brassica junceavar.tumidaTsen et Lee)的子叶为外植体,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的介导,将天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)基因导入到茎瘤芥中。对所获得的31株抗性植株进行PCR扩增,其中阳性植株为23株;Northern blot分析结果表明基因TCS在转基因植株中能够正常表达。转基因植株接种病毒试验结果表明,转基因TCS的植株对芜菁花叶病毒TuMV的侵染有一定的抑制作用。     

利用发根农杆菌（Agrobacteriom rhizogenes）介导二元载体向番茄导入TMV，CMV外壳蛋白基因的研究

本文用含ＰＲｉ（ＰＲｉＡ４ｂ）的发根农扦菌为介导,将二元载体质粒ＰＢＴＣ－８（Ｔ—ＤＮＡ上有ＴＭＶ—ＣＰ和ＣＭＶ—ＣＰ基因）,导入黑龙江省当地番茄品种。用胚轴注射,顶端切口涂抹,子叶切块穿刺等方法感染转化子菌液,诱导出毛状根。滤纸电泳检测有５０％以上的毛状根含有农抒诚和甘露碱。用抗性筛选法亦获得有卡那霉素抗性的毛状根。在穿刺感染子叶切块诱导产生的具卡那霉素抗性的愈伤组织上,获得不定芽与再生植株,经冠瘿碱,ＰＣＲ,斑点免疫结合法检测证明再生植株中有ＴＭＶ和ＣＭＶ基因产物的两种外壳蛋白和农扦碱与甘露碱,获得双转化植株。     

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因导入大豆的研究

用苏云金芽孢杆菌(BacillusthuringiensisBerliner)杀虫晶体蛋白(Bt)基因和葡糖苷酸酶(GUS)基因通过基因枪轰击和根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend)Conn)介导转入大豆(Glycinemax(L.)Merr.),诱导大豆转基因植株再生。大豆主栽品种“中黄4号”和品系8502未成熟子叶有较强体细胞胚分化能力。体细胞胚的脱水处理显著促进“中黄4号”体细胞胚的萌发。未成熟子叶的预培养有利于根癌土壤杆菌感染子叶外植体体细胞胚的分化。基因型和受体的选择,转基因体系的改进,体细胞胚的脱水处理等是提高大豆转基因效率的重要因素。     

TA29-barnase基因转化菜心

利用根癌农杆菌导入法, 以菜心带柄子叶为外植体, 对TA29-barnase基因转化菜心进行研究。获得转化植株,进行PCR、Southern blotting杂交和半定量RT-PCR检测, 表明目的基因已经整合到转化植株中, 并且目的基因在转基因植株花蕾中得到表达, 但是表达水平在不同转基因植株间存在差别; 转基因植株开花后, 均表现雄性不育, 不能产生花粉或产生没有活力的少量花粉, 自交不能结实; 用未转化植株正常花粉对雄性不育植株进行授粉, 能够正常结实; 保持系(未转化植株)与不育株杂交后代中雄性不育株与可育株的比例为1:1, 在杂交后代植株子叶期, 喷洒10 mg/L的PPT可以完全杀死可育株; 利用其他菜心品种为父本与不育株进行杂交, 获得的F1植株在生长势和产量方面表现优势, 表明开展菜心优势育种具有一定的潜力。     

TA29-barnase基因转化菜心

利用根癌农杆菌导入法, 以菜心带柄子叶为外植体, 对TA29-barnase基因转化菜心进行研究。获得转化植株,进行PCR、Southern blotting杂交和半定量RT-PCR检测, 表明目的基因已经整合到转化植株中, 并且目的基因在转基因植株花蕾中得到表达, 但是表达水平在不同转基因植株间存在差别; 转基因植株开花后, 均表现雄性不育, 不能产生花粉或产生没有活力的少量花粉, 自交不能结实; 用未转化植株正常花粉对雄性不育植株进行授粉, 能够正常结实; 保持系(未转化植株)与不育株杂交后代中雄性不育株与可育株的比例为1:1, 在杂交后代植株子叶期, 喷洒10 mg/L的PPT可以完全杀死可育株; 利用其他菜心品种为父本与不育株进行杂交, 获得的F1植株在生长势和产量方面表现优势, 表明开展菜心优势育种具有一定的潜力。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因（Bt—CpTI）甘蓝植株

以下胚轴,带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因（Bt-CpTI)导入甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株,经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明;农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株,经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

青菜的高效再生和农杆菌介导B.t.及CpTI基因的转化

分别对培养基中适宜的激素组成和AgNO3 添加浓度进行研究 ,建立了青菜下胚轴和子叶外植体的高效再生系统 ,青菜品种“矮抗青”的最高芽分化频率下胚轴可达 6 5 % ,子叶为 5 2 %左右。在此基础上 ,对影响转化频率的不同因素进行了探讨 ,共获 94株卡那霉素抗性植株。对转基因植株总DNA的Southernblot ting分析证明 ,B .t .基因和CpTI基因已整合到青菜植株的细胞核基因组中。经过抗虫性筛选试验 ,从转基因植株的T3 代筛选到 7个转B .t.基因的抗虫纯合株系和 5个转CpTI基因的抗虫纯合株系 ,并进入田间小区青菜抗虫新品种试验     

甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化

以5～7d龄的“丽春”番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg／L。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLⅡ对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLⅡ基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)甘蓝植株

以下胚轴、带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)导人甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株。经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明:农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株。经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

ACC脱氨酶基因转化白兰瓜的初步研究

用带有ACC脱氨酶基因和卡那霉素抗性基因（NptⅡ,作为报告基因）的工程根癌农杆菌转化白兰瓜子叶。通过组织培养,得到具有卡那霉素（Km)抗性的再生小苗,经NptⅡ报告基因的PCR扩增,ACC脱氨酶基因的Southern点杂交以及ACC脱氨酶活性的生理生化检测可知,ACC脱氨酶基因已成功转入白兰瓜子叶再生小苗,而且不同植株的真叶中表现出不同水平的ACC脱氨酶活性。     

利用发根农杆菌（Agrobacteriom rhizogenes）介导二元载体向番茄导入…

本文用含ＰＲｉ（ＰＲｉＡ４ｂ）的发根农杆菌为介导,将二元载体质粒ＰＢＴＣ－８（Ｔ－ＤＮＡ上有ＴＭＶ－ＣＰ和ＣＭＶ－ＣＰ基因）,导入黑龙江省当地番茄品种。用胚轴注射,顶端切口涂抹,子叶切块穿刺等方法感染转化子菌液,诱导出毛状根。滤纸电泳检测有５０％以上的毛状根含有农杆碱和甘露碱。用抗性筛选法说获得有卡那霉素抗性的毛状根。在穿刺感染子叶切块诱导产生的具卡那霉素抗性的愈伤组织上,获得不定芽与再生植株,经     

甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化

以5～7d龄的 丽春 番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg/L.通过根癌农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLII基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组.     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

RNAi载体导入黄瓜的遗传转化体系北大核心CSCD

以黄瓜(Cucumis sativus)子叶和子叶节为外植体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法建立黄瓜遗传转化体系并进行优化,将南方根结线虫(Meloidogyme incognita)寄生相关基因的RNA干扰载体导入黄瓜,通过潮霉素(Hyg)浓度梯度筛选得到99株潮霉素抗性植株。经PCR和Southern-blot检测,获得10株目的基因以单拷贝形式整合的转基因黄瓜,子叶和子叶节的Southern-blot阳性率分别为13.9%和6.9%。该研究建立并优化了RNA干扰载体导入黄瓜的高效遗传转化体系,成功获得了转基因黄瓜植株。     

新疆盐生植物耐盐基因NHX转化甘蓝型油菜及其耐盐性的初步研究

以甘蓝型油菜带柄子叶为转化受体,通过根癌农杆菌EHA105(Agrobacterium tumefaciens)介导将盐角草(Salicornia)的Na /H 反向运输体基因NHX导入新疆主栽油菜1khp11品系,获得了抗卡那霉素的再生植株,并对影响遗传转化的一些关键因素进行了研究。实验结果表明:带柄子叶在含有2,4-D的培养基上经过2d短时间的预培养后在菌液浓度OD600为0.3时在28℃摇床浸染15min时卡那抗性绿苗率可达10%￣12%;经过抗性植株的PCR及RT-PCR检测证明外源基因已整合到油菜基因组中,并通过表型实验证实由于外源基因的导入提高了植株的耐盐能力。     

纤维植物罗布麻发根的诱导及植株再生

利用3种发根农杆菌(LBA9402.R601,和R1000)转化纤维植物罗布麻无菌种子苗的根茎叶不同外植体部位,首次诱导其生成发根并实现了直接由发根途径的植株再生.罗布麻发根诱导与所用的发根农杆菌菌株,外植体部位及光周期密切相关.发根农杆菌LBA9402感染罗布麻的根外植体,实现了最高转化率达100%.与LBA9402及R601相比,被发根农杆菌R1000感染的根外植体适合在黑暗环境下培养.其诱导生成的发根密度可达平均每个外植体22条.在不加激素的1/2 MS培养基上,LBA9402和R601诱导产生的发根可以诱导生成不定芽,不定芽诱导率达20%.不定芽切下后,在不加激素的1/2 MS培养基上2周内可以诱导生根.通过聚合酶链式反应(PCR)对发根及再生植株进行了鉴定,证明发根农杆菌的T-DNA插入了植物的基因组.为罗布麻的分子育种建立了稳定的转化及再生体系,为下一步通过转入外源基因改善其农艺性状奠定了基础.