甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化

以5～7d龄的 丽春 番茄无菌苗子叶作为外植体,研究了子叶外植体对抗生素卡那霉素的敏感性,抗生素卡那霉素对番茄筛选的适宜浓度为70mg/L.通过根癌农杆菌 Agrobacteriumtumefaciens 介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII对番茄的遗传转化,获得转化番茄抗性植株,组织化学法有阳性表现、PCR特异扩增及Southern杂交检测出现特异条带,表明MBLII基因已顺利整合到转基因番茄植株的基因组.     

番茄果实特异性启动子的克隆与遗传转化研究

为了实现外源基因在番茄果实中的高效和特异表达,克隆了番茄果实特异基因多聚半乳糖醛酸酶基因( Polygalacturonase,PG)的启动子.以中蔬四号番茄为材料,建立并优化了以子叶为外植体的番茄高效再生和遗传转化体系;以GUS为报告基因,构建PG:GUS植物表达载体,转化番茄.结果表明,在1.0 mg/L ZT的MS分化培养中,番茄子叶的发芽率最高,芽的诱导率高达91％,且发生畸态芽和褐化的外植体最少;通过抗生素浓度对农杆菌的抑制效果试验发现,当头孢霉素的浓度为200 mg/L时,抑制农杆菌的效果最好;成功克隆了番茄PG启动子,将PG启动子驱动的GUS基因转入番茄,对转基因后代果实的GUS染色表明,PG启动子驱动的外源基因在果实中特异表达.     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因（Bt—CpTI）甘蓝植株

以下胚轴,带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因（Bt-CpTI)导入甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株,经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明;农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株,经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

利用根癌农杆菌和基因枪法转化获得转抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)甘蓝植株

以下胚轴、带柄子叶和茎尖为外植体,利用根癌农杆菌和基因枪法将抗虫融合蛋白基因(Bt-CpTI)导人甘蓝品种“中甘8号”,得到了13株卡那霉素抗性植株。经PCR扩增反应和Southern blot分子验证表明:农杆菌介导转化下胚轴和带柄子叶来源的Ⅰ型抗性植株均为转基因植株,而农杆菌介导转化茎尖外植体得到的Ⅱ型抗性植株属“假阳性”植株,基因枪介导转化茎尖的2株Ⅲ型植株中,有1株是非转基因植株。经胰蛋白酶抑制剂活性分析和抗虫测试证明,部分转基因植株有较高的胰蛋白酶抑制剂活性和抗菜青虫能力。     

转HSl^prol基因番茄植株的获得

目的：为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HSl^prol。番茄植株。方法：在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHAl05感受态细胞,然后用冻融法将HSl^prol基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HSl^prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论：目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HSl^prol基因番茄植株。     

番茄子叶外植体转化系统的优化

目的 :对番茄子叶外植体的转化进行优化 ,为进行转基因番茄的研究奠定基础。方法 :通过正交设计实验 ,以子叶外植体的存活天数为观察指标 ,分别对农杆菌稀释浓度、浸染时间和转化方式等条件进行优化。结果 :在子叶预培养 2d、活化农杆菌稀释倍数约 30倍、侵染时间为 1 0min、共培养时间为 2d的情况下 ,子叶存活时间最长 ,抗性芽产生频率达 2 5 %。结论 :获得了高效的番茄子叶外植体转化系统 ,为进行基因的转化奠定了基础     

ACC脱氨酶基因转化白兰瓜的初步研究

用带有ACC脱氨酶基因和卡那霉素抗性基因（NptⅡ,作为报告基因）的工程根癌农杆菌转化白兰瓜子叶。通过组织培养,得到具有卡那霉素（Km)抗性的再生小苗,经NptⅡ报告基因的PCR扩增,ACC脱氨酶基因的Southern点杂交以及ACC脱氨酶活性的生理生化检测可知,ACC脱氨酶基因已成功转入白兰瓜子叶再生小苗,而且不同植株的真叶中表现出不同水平的ACC脱氨酶活性。     

转HS1prol基因番茄植株的获得

目的为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HS1prol番茄植株.方法在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHA105感受态细胞,然后用冻融法将HS1prol基因转入农杆菌中.通过农杆菌介导法将HS1prol基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株.用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定.结果与结论目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HS1prol基因番茄植株.     

定性PCR技术及卡那霉素对8个番茄品种的转基因检测

本研究利用定性PCR技术对8个不同番茄品种中外源基因35S启动子、NPTⅡ基因和NOS终止子进行检测.实验结果表明,阳性对照可以稳定扩增到预期的大小片段,而待检测品种和阴性对照则没有扩增到预期产物.利用100 mg/L的卡那霉素对8个不同番茄品种的种子进行萌发试验,再用50 mg/L的卡那霉素对番茄外植体(子叶和下胚轴)进行抗性验证,结果显示卡那霉素抗性筛选实验结果与定性PCR结果一致.本文通过对这两种检测方法的优缺点进行研究分析及比较,初步建立了一个对不同品种番茄进行转基因检测的体系.     

转HS1~(pro1)基因番茄植株的获得

目的:为了减少根结线虫对番茄的危害,研究并获得转抗线虫基因HS1pro1番茄植株。方法:在鉴定表达载体之后,采用CaCl2法制作农杆菌EHA105感受态细胞,然后用冻融法将HS1pro1基因转入农杆菌中。通过农杆菌介导法将HS1pro1基因导入无菌番茄外植体中,获得抗根结线虫转化再生植株。用卡那霉素筛选到再生植株后,提取抗性芽的基因组,利用设计好的引物进行PCR鉴定。结果与结论:目的基因已整合到番茄基因组中,获得了转HS1pro1基因番茄植株。     

甘蓝型油菜抗虫转基因植株及其抗性分析

通过油菜子叶外植体－农杆菌共培养法将苏云金杆菌杀虫蛋白基因导入甘蓝型油菜,获得抗虫的转基因植株。带有１￣２ｍｍ子叶柄的油菜子叶经农杆菌感染后,共培养２￣３天,然后转移到附加１５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的ＭＳ选择培养基上筛选转化愈伤组织及不定芽。卡那霉素抗性苗相继在含２０￣５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的选择培养基上继代培养,再转移到含２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的生根培养基上诱导生根。以苏云金杆菌杀虫蛋白基因为探针,进行１     

液泡转化酶反义基因对番茄的遗传转化

以'中蔬4号'番茄的子叶为试材,通过农杆菌介导法遗传转化,将液泡转化酶反义基因导入再生植株,经PCR和Southern斑点杂交检测证明,5株转化植株基因组中整合有目的基因.遗传转化最佳条件为:在附加1.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IAA的MS培养基上再生培养,外植体预培养2 d,菌液浓度OD600=0.5,侵染时间5 min,共培养2 d.遗传转化后,对整合有目的基因的再生番茄叶片液泡转化酶活性测定,表明液泡转化酶活性明显受到抑制.获得的转基因植株为进一步研究液泡转化酶基因的功能奠定了基础.     

转WMV-2 CP基因黄瓜植株的再生

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体 ,通过叶盘转化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的转基因系统。农杆菌菌株为LBA44 0 4,内含双元载体pBPMWMV。该质粒载体带有一个npt Ⅱ基因 (筛选具有卡那霉素抗性的植株 )和一个WMV 2CP基因。抗卡那霉素 (Kanr)的黄瓜植株经DNA分子点杂交、PCR检测以及Southernblot证实 ,外源的WMV 2CP基因确实已导入黄瓜细胞且能稳定地遗传到子一代。对WMV 2CP基因在子一代的分离进行了统计。获得的转基因子一代植株对WMV 2表现出较强的抗性 ,可以延迟发病时间 ,减轻发病程度     

农杆菌介导的苜蓿次级体细胞胚的遗传转化

采用农杆菌菌株GV3101感染子叶期苜蓿体细胞胚来研究苜蓿次级体细胞胚的遗传转化方法。农杆菌菌株GV3101双相载体pCAMBIA2301,此双相载体具有gus报告基因和nptⅡ抗卡那霉素筛选基因。感染的子叶期苜蓿体细胞在75 mg/L卡那霉素筛选压下,经过一系列诱导培养,最终获得转基因植株。然后,通过GUS组织化学定位分析来检测转基因植株不同器官中的GUS表达,并进一步通过PCR和Southern杂交确定转基因的稳定整合和转化率。结果表明转基因植株不同器官均有GUS表达,整合的nptⅡ基因的拷贝数是1~4,获得的转基因植株的转化率是65.82%。     

转果聚糖蔗糖转移酶基因( Sac B)美丽胡枝子的获得

采用农杆菌介导的遗传转化方法,将来自枯草杆菌的果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB)导入美丽胡枝子,以提高胡枝子抵御干旱胁迫和盐胁迫的能力。以美丽胡枝子子叶节为外植体,通过与含有植物双元表达载体pKP的农杆菌LBA4404共培养,将SacB基因导入美丽胡枝子基因组。经卡那霉素筛选后,共获得62株卡那霉素抗性植株。经PCR特异性扩增和PCR-Southern杂交,证明有5株再生植株基因组DNA中整合了SacB基因。通过RT-PCR分析,结果表明SacB基因均获得表达。经过200mmol/LNaCl和5%PEG模拟胁迫,发现转基因植株美丽胡枝子中,可溶性糖含量在任何时候均高于未转化植株,并比对照拥有更高的抗干旱胁迫和盐胁迫能力。     

青菜的高效再生和农杆菌介导B.t.及CpTI基因的转化

分别对培养基中适宜的激素组成和AgNO3 添加浓度进行研究 ,建立了青菜下胚轴和子叶外植体的高效再生系统 ,青菜品种“矮抗青”的最高芽分化频率下胚轴可达 6 5 % ,子叶为 5 2 %左右。在此基础上 ,对影响转化频率的不同因素进行了探讨 ,共获 94株卡那霉素抗性植株。对转基因植株总DNA的Southernblot ting分析证明 ,B .t .基因和CpTI基因已整合到青菜植株的细胞核基因组中。经过抗虫性筛选试验 ,从转基因植株的T3 代筛选到 7个转B .t.基因的抗虫纯合株系和 5个转CpTI基因的抗虫纯合株系 ,并进入田间小区青菜抗虫新品种试验     

几种白菜类蔬菜卡那霉素抗性的研究

标记基因的利用是筛选和鉴定基因转化的细胞、组织和转基因植株的有效方法。针对目前遗传转化中常用的卡那霉素(Km)抗性基因,对几种白菜类蔬菜的卡那霉素抗性作了较系统的探索,发现5.0 mg/L Km可完全抑制大白菜、小白菜及菜心子叶的再生;幼苗Km抗性测验表明各品种均表现出随着Km浓度的提高,子叶黄化率升高、根茎变短、鲜重减轻的趋势。白菜类蔬菜的卡那霉素抗性检测为遗传转化和阳性后代筛选奠定了基础。     

影响根癌农杆菌介导甜瓜转化NP-1基因的外部因子研究

以新疆伽师、皇后两个甜瓜品种的子叶切块与农杆菌共培养,将NP-1基因导入甜瓜。以再生植株的PCR检测阳性和卡那霉素抗性作为转化植株的初步判定。研究了甜瓜转化的外部因子：甜瓜子叶外植体经3d预培养,重悬于MS液体培养基使菌液浓度达OD600为0．6后进行侵染8～12min,再经3d共培养对转化最为有利;在侵染前进行0．2mg／L甘露醇高渗处理可提高转化率6．6％,乙酰丁香酮在甜瓜的转化中并未有显著影响。转化中卡那霉素合适筛选压力为100mg／L,转化后抑菌氨苄青霉素浓度为500mg／L有利于获取转化植株,转化率可达到12％。     

根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植的再生

用根癌农杆菌共培养法把外源基因导入甘蓝型油菜主要栽培品种“云北２号”,获得转基因植株。所用外植体为带有１－２ｍｍ子叶柄的完整子叶,根癌农杆菌为Ａ２０８ＳＥ（ｐＴｉＴ３７－ＳＥ,ｐＲＯＡ９３）。Ｔｉ质粒ｐＲＯＡ９３带有ＮＰＴⅡ及ＧＵＳ嵌合基因。共培养２天后转到附加２５ｍｇ／Ｌ卡那霉素的分化培养基（ＭＳ＋４．５ｍｇ／ＬＢＡＰ）上。ＡｇＮＯ３和羧苄青霉素促进芽的分化,头孢霉素则有抑制作用。最高转化频率为     

ACC氧化酶和ACC合成酶反义RNA融合基因导入番茄和乙烯合成的抑制

从番茄品种强力米寿的总DNA中克隆番茄果实特异启动子2A11,以番茄成熟果实的RNA为模板,进行RT-PCR扩增,克隆番茄全长的ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因片段。完成两个基因的克隆和测序后,将888bp的番茄ACC氧化酶基因和943bp的ACC合成酶基因片段串联,构成全长1837bp的融合基因。将该融合基因以反义的方向插入植物双元载体pYPX145中番茄果实表达特异启动子下游,获得ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因融合的植物双元载体pOSACC。该载体外源基因表达单元的两端含两个烟草SAR序列,利于转基因的稳定遗传。以番茄栽培品种合作903子叶和下胚轴为外植体,利用根癌农杆菌进行基因转化,通过200mg/L卡那霉素选择和GUS检测,获得了105株番茄GUS阳性植株,转基因番茄果实在当代表现明显耐贮特点。经过4代的耐贮和果实农艺性状的综合选择,获得了两个表现良好的株系DR-1和DR-2,两株系果实乙烯释放量显著下降,是未转基因材料的9.5%,番茄的贮存期在50天以上。