正交设计优化绿竹ISSR-PCR体系和引物筛选

旨在建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并筛选适于绿竹ISSR-PCR分析的高多态性引物。以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用正交试验方法,对d NTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA用量设计5因素4水平试验,采用极差分析法和方差分析法对试验结果进行分析。并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序。并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,d NTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为1.5 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA浓度为60 ng,10×PCR Buffer体积为2μL、剩下用灭菌ddH_2O补全。各因素影响大小依次是:Mg~(2+)d NTPs模板DNATaq DNA聚合酶引物。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次,72℃延伸10 min,4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。     

栝楼ISSR-PCR体系的正交优化

目的：建立栝楼最佳ISSR-PCR正交优化体系,为开展栝楼ISSR分子标记奠定技术基础。方法：采用正交试验设计对影响栝楼ISSR-PCR扩增的重要参数（DNA模板、MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶）进行优化试验,同时进行不同温度梯度试验和ISSR体系筛选。结果：最佳的栝楼ISSR-PCR的反应体系（20μl）为：30ng模板DNA,2.0mmol/L MgCl2,0.3mmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶;退火温度为52℃-55℃;扩增反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,52℃退火1min,72℃延伸2min,35个循环;72℃延伸7min;4℃保存。结论：建立了栝楼的最佳ISSR反应体系,为栝楼种质鉴定提供了更客观可靠     

均匀设计优化建兰ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响建兰ISSR-PCR体系的引物、Mg^2＋、dNTP和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化,建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,舍引物0．25μmol／L、Mg^2＋ 2．5mmol／L,dNTP0．2mmol／L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA40ng．在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度,以及ISSR引物进行筛选．筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min;接着进行32个循环：94℃变性35S,52～56℃退火45S,72℃延伸90s;循环结束后,72℃延伸10min．同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物．     

三角梅ISSR反应体系的建立和优化

对影响三角梅ISSR-PCR扩增反应的各个参数进行优化,建立适合三角梅的ISSR反应体系:PCR反应体积为20μL,其中10×buffer(含Mg2+)2.0μL,dNTP250μmol/L,Taq酶1.0U,引物0.3μmol/L,模板DNA20ng。扩增程序:94℃预变性5min;94℃变性1min,51.6℃退火1min,72℃延伸2min,34个循环;最后72℃延伸7min。该反应体系标记点位清晰、稳定、重复性好,适宜三角梅ISSR分析,为应用ISSR技术鉴定三角梅种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

野生毛木耳ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为获得条带清晰,重复性好,多态性高的野生毛木耳ISSR扩增结果,通过单因子试验对ISSR-PCR反应条件进行了优化。确定了ISSR分析的最佳PCR条件:25μL反应体系中模板DNA25ng、dNTPs0.24mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+0.9mmol/L、引物2μmol/L、10×PCR buffer2.5μL、ddH2O12.6μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。在此基础上初步筛选出25条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行野生毛木耳种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个适合的程序。     

薰衣草高质量DNA提取及ISSR-PCR多重化体系的建立

以伊犁薰衣草‘701’新鲜叶片为材料,对4种基因组DNA提取方法进行比较,并通过单因子梯度比较试验结合L9(34)正交优化设计,对ISSR-PCR扩增体系中退火温度、DNA、Mg2+、dNTP和引物浓度进行最佳条件及配比筛选。结果表明,改良3×CTAB法是薰衣草高质量DNA少量提取的最佳方法 ;建立薰衣草ISSR-PCR扩增优化体系为,20μL反应体系中包括模板DNA 50 ng,Mg2+3 mmol/L,dNTP 0.3 mmol/L,引物0.3 mmol/L,Taq酶1 U;扩增程序退火温度为56℃。运用本试验建立的ISSR-PCR优化体系,对5份薰衣草种质进行了初步验证,获得了良好的多样性扩增条带。     

黄鳝ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

以黄鳝基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,对各反应因子、引物退火温度和循环参数进行优化.建立了黄鳝的最适ISSR-PCR反应体系,25 μl反应体系中含2.5 mmol/ L Mg2+,250 μmol/ L dNTPs,0.25 μmol/ L 引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,30 ng DNA模板.最佳反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性40 s,48～57℃复性40 s(随引物而确定),72℃延伸1.5 min,循环次数40;72℃延伸10 min.利用所建立的ISSR反应体系,获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带.     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化

目的:为了对银杏进行分子鉴定和遗传关系的分析,建立银杏ISSR-PCR的最佳扩增反应体系。方法:采用正交设计和单因素梯度实验,对影响ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、dNTP、引物、模板DNA及Taq DNA聚合酶)进行筛选及优化。结果:银杏25μL ISSR最佳扩增反应体系包含10×Taq反应缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2、0.45 mmol/L dNTP、1.2μmol/L引物(UBC861)、10 ng模板DNA及0.9 U Taq DNA聚合酶,使用此ISSR扩增反应体系,获得了10株不同性别银杏DNA的清晰条带,验证了该体系的稳定性。结论:优化的反应体系为采用ISSR分子标记技术对银杏进行遗传多样性分析、遗传育种和转基因等研究奠定了一定的理论基础。     

黑籽南瓜ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

以云南个旧黑籽南瓜叶片基因组DNA为模板,固定反应程序,采用L_(16)(4~5)正交试验设计的方法,对影响ISSR-PCR反应的五因素(dNTPs,Mg~(2+),引物,Taq DNA聚合酶,模板DNA)在四个水平上进行优化试验。研究建立起了适于云南黑籽南瓜ISSR-PCR的最佳反应体系:25μl反应体系中含10×buffer 2.5μl、0.15mmol/L dNTPs、2.5mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、1.5U Taq DNA聚合酶、DNA模板15ng。扩增程序为:95℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸90s,进行35个循环,最后72℃延伸7min。该优化体系的建立为今后用ISSR标记技术进行黑籽南瓜种质资源的分类鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。     

广西甜茶ISSR-PCR反应条件的建立与优化

为了探讨广西甜茶ISSR实验中的多种因素对实验结果的影响,采用单因素法对PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+, dNTP,引物, Taq酶和模板DNA)在5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度和循环次数。结果表明：25滋L的最佳反应体系为,1×PCR Buffer、MgCl22.0 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、引物0.8滋mol/L、Taq DNA聚合酶0.75 U、模板DNA 80 ng;最佳反应程序为：在94℃下进行3 min预变性;随后循环扩增35次(包括94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min);最后在72℃下延伸10 min。本研究建立的广西甜茶的最佳ISSR-PCR反应条件为进一步进行遗传多样性研究奠定了基础。     

大帽藓科植物ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立大帽藓科ISSR-PCR实验最佳反应体系。[方法]提取大帽藓科的基因组DNA,利用5因素4水平的正交设计实验方法对大帽藓科植物ISSR-PCR反应体系进行最佳反应体系的筛选。[结果]大帽藓科植物ISSRPCR的最佳反应体系为(20μL):即20μL体系中,PCR Buffer 2. 0μL、Mg2+2. 25 mmol/L,d NTP 0. 2 mmol/L,引物0.65μmol/L,Taq DNA聚合酶0. 7 U,模板DNA 10 ng。5个因素对该反应体系的影响顺序为:Mg2+引物 d NTP Taq DNA聚合酶模板DNA。利用该体系,在UBC808等13种引物中进行验证,均能得到有效的扩增条带。[结论]通过对大帽藓科基因组DNA的提取及体系优化,获得了大帽藓科植物最佳反应体系,为后续应用ISSR技术鉴定大帽藓科种质资源以及遗传多样性研究奠定了基础。     

正交设计优化紫萼藓科植物的ISSR-PCR反应体系

目的:建立紫萼藓科(Grimmiaceae)植物ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:通过L16(45)正交试验,研究了dNTP浓度、镁离子浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度这5个因素在4个水平上对ISSR-PCR的影响。结果:建立了紫萼藓科ISSR-PCR反应的最佳反应体系,其中dNTPs浓度为0.8mmol/L、Mg2+浓度为3.0mmol/L、模板为15ng、引物浓度为1.4μmol/L、Taq酶量2U,总体积为25μl。反应程序为:扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,48～52℃退火1min,72℃延伸2min,共40个循环;72℃延伸10min;4℃保存。采用引物UBC812等均能够得到有效扩增。结论:该优化体系的建立为下一步对紫萼藓进行ISSR分子标记奠定了基础。     

紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

以紫云英为研究材料,用哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物和11种株系紫云英品种的DNA为模板进行PCR扩增,筛选出33条扩增条带较好的ISSR引物,对其中的ISSR引物进行梯度PCR,筛选出最佳的退火温度。再采用正交试验和单因素试验相结合的方法对紫云英ISSR-PCR反应体系的5种因素(模板、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化浓度。确立了适合紫云英的ISSR分析的反应体系。在25μl反应体系中,其反应浓度为:DNA模版50.00ng,Mg2+2.00mol/L,Taq聚合酶1.0 U,dNTP 0.25mmol/L,引物0.20μmol/L,2.5μl 10×buffer。本试验为以后利用ISSR技术进行紫云英遗传多样性分析和物种保护奠定了技术基础。     

黔产宽叶缬草ISSR反应体系的建立与优化

旨在建立稳定、可靠的宽叶缬草ISSR反应体系。以10个水平单因素试验为基础,应用L16(45)正交设计对反应体系中4个主要因子在4个水平上进行组合优化,并采用直观法、极差法和方差法对试验结果进行分析;利用优化的反应体系,筛选引物以及最佳退火温度;同时,以9份不同产地宽叶缬草样品对反应体系进行稳定性检测。结果显示,宽叶缬草25μL ISSR最佳反应体系为:2.5μL 10×Taq Buffer,2.0 mmol/L Mg2+,0.28 mmol/L d NTPs,0.3μmol/L引物,1.75 U Taq DNA聚合酶,60 ng DNA模板,dd H2O补齐;影响大小依次是:Mg2+引物d NTPsTaq DNA聚合酶;确定了各引物的最佳退火温度以及筛选出扩增条带清晰稳定的17条ISSR引物;稳定性实验表明,该体系稳定可靠。优化出宽叶缬草ISSR最佳反应体系并筛选出理想的引物。     

胡麻专化型尖孢镰刀菌ISSR-PCR最佳反应体系的建立

采用正交试验设计原理,对尖孢镰刀菌ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素进行优化筛选,确立了适合尖孢镰刀菌ISSR分析的反应体系,即25μL PCR反应体积中合有20 ng模板DNA、1 U Taq酶、0.4 μmol/L引物、0.2 mmol/LdNTPs、4.0 mmol/L Mg2+和2.5 μL 10 × buffer.PCR反应最佳退火温度根据引物而定,在此基础上筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.此研究为今后利用ISSR技术分析尖孢镰刀菌遗传多样性和群体结构奠定了基础.     

大苞萱草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用正交设计和单因子试验两种方法对影响大苞萱草ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2+,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验。正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平。单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平。两种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了大苞萱草ISSR-PCR的最佳反应体系。在20μL的反应体系中:Taq酶1 U,Mg2+1.5 mmol/L,dNTP0.20 mmol/L,引物0.4μmol/L,1×PCR buffer,30 ng模板DNA。在此基础上筛选出10个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。     

丹参ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

利用正交试验设计的方法,从引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度4种因素3个水平,对丹参ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCR buffer、200μmol/L dNTP、1.0μmol/L引物、1.5mmol/L Mg2+和1 U Taq DNA聚合酶,最佳模板DNA浓度为20～60ng,引物UBC 835的最佳退火温度为51.7℃。     

齿裂菌属和皮下盘菌属ISSR-PCR最佳反应条件的研究

在利用ISSR技术分析齿裂菌属和皮下盘菌属遗传多样性的研究中,为获得条带清晰、重复性好的ISSR扩增结果,对影响ISSR-PCR的条件进行了筛选,确定了此类菌物ISSR-PCR反应的最适宜条件:在15μLPCR反应体系中,10倍Taq酶缓冲液1.5μL,DNA模板8ng/μL,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,引物浓度0.4μmol/L,Taq酶1.00U,ddH2O9.0μL。最佳退火温度因不同的引物而定,最佳循环次数为35次。     

黑木耳ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验设计的方法,对黑木耳ISSR-PCR(简单重复序列区间-多聚酶链反应)反应体系中的5种主要因素(Taq聚合酶,Mg2+,模板DNA,dNTP及引物)4个水平进行优化筛选,确立了适合黑木耳ISSR分析的优化反应体系(20μL),通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。     

均匀设计在枇杷ISSR-PCR反应体系优化中的应用

本实验通过U25(54)均匀设计实验研究,对枇杷ISSR-PCR分子标记体系中模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物5个组分的浓度进行优化.获得25 μL反应体系中各成分的适宜浓度或用量分别是:模板DNA为10ng、dNTPs为0.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶为1 U、Mg2+为2.5 mmol/L,引物为0.4 μmol/L.与单因素梯度优化体系相比,操作简便,简化了实验步骤,获得的实验结果可靠,从100条ISSR引物中筛选出27条扩增良好的引物,并获得了这些引物的最佳退火温度,经琼脂糖凝胶电泳获得了清晰的图谱.这一优化体系的建立为进一步利用ISSR标记技术进行枇杷种质鉴定及遗传多样性分析提供了一个标准化程序.