高山被孢霉Δ6Ⅱ-脱饱和酶的克隆、表达和功能鉴定

产油微生物高山被孢霉中Δ6脱饱和酶是决定ω3/ω6脂肪酸代谢流的关键酶,该酶对不同底物的催化特性直接决定该菌体内脂肪酸的流向。在已完成基因组测序的高山被孢霉ATCC32222中经注释发现它存在两种Δ6脱饱和酶(Δ6-Ⅰ和Δ6-Ⅱ),选择对其中的Δ6-Ⅱ脱饱和酶进行克隆、表达和功能鉴定。首先以p YES2/NT C质粒为骨架构建了Δ6-Ⅱ脱饱和酶基因(FADS6-Ⅱ)的表达载体(p YES2/NT C-FADS6-Ⅱ),并转化至酿酒酵母中进行诱导表达,进一步通过在重组菌培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察Δ6-Ⅱ脱饱和酶对各底物的偏好作用。实验结果表明,在分别添加0.5 mmol/L亚油酸(LA)和0.5 mmol/Lα-亚麻酸(ALA)时,Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为42.94%,对ALA没有催化作用。而当底物添加方式改为同时添加LA和ALA时(分别为0.25 mmol/L),Δ6-Ⅱ脱饱和酶对LA的转化率为37.12%,对ALA仍没有催化作用。该实验结果为高山被孢霉中Δ6-Ⅱ脱饱和酶的催化功能研究提供了理论依据。     

高山被孢霉中Δ9脂肪酸脱饱和酶的表达、纯化和其细胞色素b_5功能域的鉴定

在毕赤酵母中表达和纯化源自高山被孢霉ATCC 32222的膜结合Δ9-I脂肪酸脱饱和酶,测定其活性,并探究其细胞色素b_5功能域的性质。构建含有高效纯化标签ZZ-tag的表达载体;用Western blotting和SDS-PAGE筛选Δ9-I脂肪酸脱饱和酶高表达量转化子;通过梯度离心和去垢剂筛选确定膜蛋白质提取条件;采用IgG亲和纯化色谱和阴离子交换色谱对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶进行纯化;利用酿酒酵母细胞破碎物为底物考察Δ9-I脂肪酸脱饱和酶活性;通过波长扫描和Na_2S_2O_4还原实验对Δ9-I脂肪酸脱饱和酶细胞色素b_5功能域进行表征。结果显示,目的蛋白质被成功表达并筛选出高表达量转化子;20 000g离心1h为最佳膜分离条件,Fos-Choline-16为最佳去垢剂;纯化后的Δ9-I脂肪酸脱饱和酶结构完整,具有细胞色素b_5功能域;在酿酒酵母提取物中Δ9-I脂肪酸脱饱和酶对C16:0和C18:0底物的转化效率分别为(16.88±9.32)%和(20.61±7.55)%;波长扫描显示Δ9-I脂肪酸脱饱和酶在411nm处有强吸收,并且在Na_2S_2O_4作用下被还原至422nm,说明细胞色素b_5功能域在体外能够被还原。因此,含有细胞色素b_5功能域的脂肪酸脱饱和酶的首次成功表达、纯化和鉴定为亚铁血红素脂肪酸脱饱和酶脱饱和反应机制的研究奠定了基础。     

来源于线虫Caenorhabditis briggssae 的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。     

来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因

ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFAs）是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3 PUFAs的含量与ω-6 PUFAs（其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反）相比很低。而对于人体,无论ω-3 PUFAs的过低还是ω-6 PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3 PUFAs含量的途径或者大量生产ω-PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA31-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸（从十八碳到二十二碳）。Ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。Ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。     

麦胚无细胞蛋白合成体系的改进

麦胚无细胞蛋白合成体系的特点是内源信息含量低,对外源RNA 反应灵敏,故在检测外源mRNA 和tRNA 的功能和蛋白质合成机制的研究中起着重要的作用。按Marcus 等的方法,制备无tRNA 的麦胚无细胞蛋白合成体系S_(100-)     

无细胞蛋白质合成系统的研究进展及应用前景

无细胞蛋白质合成系统是现代迅速发展的蛋白质表达系统,以细胞抽提物中酶和蛋白质因子等作为基本反应体系,添加外源模板、底物以及能源物质等维持体系运作,最终在体外合成目标蛋白质。无细胞蛋白质合成系统突破了细胞的生理限制,能够灵活地进行蛋白质合成,极大地提高了蛋白质的产量,不仅可以作为研究转录和翻译的研究工具,而且可以实现蛋白质的高通量表达,在诸多领域带来了突破性的进展。现主要针对无细胞蛋白质合成系统的能量供给、蛋白质的稳定性和折叠修饰以及应用进行综述,以期推动对该技术的理解和应用。     

无细胞蛋白表达系统新进展及在生物制药工程中的应用

无细胞蛋白表达体系是一种以细胞抽提物为基础的体外合成蛋白质表达技术,具有遗传背景简单、反应操控简便等特点,已成为研究生物反应系统的重要技术手段。在研究人员的不断努力下,反应体系从原核扩展到真核蛋白质合成体系,而且目标蛋白表达量从毫克级提高到数克级每升,成本不断降低,反应规模可达到百公升级。近年来,无细胞蛋白表达系统在复杂蛋白、毒性蛋白和膜蛋白表达方面的优势逐渐体现,展示了其在生物制药领域的重要应用潜力。总之,无细胞技术已经成为异源蛋白质高效合成和生物制药领域中有巨大潜力的新策略。     

人造细胞内蛋白质合成的研究进展

无细胞蛋白质合成(cell-free protein synthesis,CFPS)是一种在体外快速合成目标蛋白质的方法,通过构建含有CFPS系统的人造细胞,能够实现蛋白质的高通量表达和功能性膜蛋白的体外重构.本文详细综述了4种CFPS系统(包括大肠杆菌裂解液、兔网织红细胞裂解液、小麦胚芽提取物、酵母提取物)的适用范围和优缺点,总结了基于CFPS系统构建的人造细胞体系内蛋白质合成的研究现状,以及该领域面临的挑战及未来的发展方向.     

骨骼肌特异表达载体的构建与验证

目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性.方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1 - SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT - PCR检测证明其表达有效性.结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT - PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录.结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础.     

“自我剪切”2A肽介导的Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶以及过氧化氢酶在转基因小鼠肌肉表达研究

哺乳动物因为缺乏Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶,不能自身合成必需的多不饱和脂肪酸．目前,通过转基因技术在哺乳动物体内表达ω-3脂肪酸脱氢酶,能将长链的n-6多不饱和脂肪酸转化成n-3多不饱和脂肪酸,造成体内长链的n-6多不饱和脂肪酸含量显著减低．本研究通过自我剪切2A肽介导Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶(FAT-2和FAT-1)以及人过氧化氢酶(human catalase,hCAT)在小鼠的肌肉同时表达．结果表明,转基因小鼠肌肉中长链n-3多不饱和脂肪酸含量提高2.6倍,长链n-6多不饱和脂肪酸含量没有显著变化,而n-6/n-3比例显著降低(P < 0.01)．同时蛋白质印迹检测到人过氧化氢酶hCAT在小鼠的肌肉组织中表达,且过氧化氢酶活性比野生型小鼠显著提高(P < 0.01)．     

高山被孢霉Δ5脱饱和酶基因的分离与验证

花生四烯酸(arachidonicacid)是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6(Mortierellaalpina)中通过RT-PCR分离了可能的编码Δ5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有Δ5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b5结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱(GC-MS)分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出Δ5脱饱和酶基因。     

转基因哺乳动物细胞自合成多不饱和脂肪酸

亚油酸、亚麻酸是哺乳动物体内的必需脂肪酸,但哺乳动物由于缺乏△12和ω-3脂肪酸脱氢酶而自身不能合成．△12和ω-3脂肪酸脱氢酶存在于真菌、植物和一些低等动物中．为了实现哺乳动物细胞亚油酸的自身合成,克隆了线虫编码△12脂肪酸脱氢酶的FAT-2基因eDNA序列,通过优化密码子,构建真核表达载体,稳定转染细胞,经抗生素筛选获得稳定整合FAT-2基因的CHO细胞．PCR和RNA印迹（Northern blot）验证了基因的整合和表达．气相色谱分析细胞的脂肪酸含量表明,FAT-2基因的表达显著提高了转基因细胞中亚油酸的含量,亚油酸含量为阴性对照细胞的2．4倍．研究结果表明,低等动物△12脂肪酸脱氢酶可以重建哺乳动物多不饱和脂肪酸合成途径,并利用细胞中的油酸合成亚油酸．上述研究为进一步利用转基因技术促进农业动物合成多不饱和脂肪酸从而提高食品营养价值奠定基础．     

植物种子a-亚麻酸形成及调控机理研究进展

a-亚麻酸是人体必需但不能自身合成的ω-3系列多不饱和脂肪酸,主要来源于植物油脂。由于大宗油料作物种子油脂中ALA含量普遍较低,所以探寻新的种质资源,了解a-亚麻酸形成及调控机理,对于油脂营养膳食健康及植物油脂改良具有重要意义。种子中富含a-亚麻酸的陆生植物资源有紫苏、亚麻、杜仲、油用牡丹、奇亚、藿香、香薷、猕猴桃、星油藤等。在植物中,ω-3FAD是催化LA转化生成ALA的关键酶,ω-3FAD由在质体中FAD3及在内质网中的FAD7及FAD8组成。目前通过基因组及转录组研究已极大的丰富了ω-3FAD基因家族的鉴定及研究。其中,FAD3基因是种子ALA合成的关键基因,其表达受多个转录因子的调控,bZIP、WRI1、LEC、ABI3、FUS3、ASIL1和PKL等转录因子通过相互作用调控FAD3基因表达,决定油料作物种子中a-亚麻酸的含量。本文综述了高含量a-亚麻酸油料植物资源分布,以及主要油料植物种子中油脂脂肪组成及ALA的含量,种子ALA生物合成基本途径及关键基因,植物ω-3脂肪酸脱饱和酶类型及功能以及ω-3FAD的关键调控因子,以期为高ALA植物新资源的利用,以及油料植物脂肪酸成分改良等相关研究提供理论依据。     

被孢霉△~9脂肪酸脱饱和酶基因保守区的cDNA克隆及结构分析

被孢霉被广泛采用用于发酵生产γ-亚麻酸、花生四烯酸和EPA等多不饱和脂肪酸。为了解决发酵产率过低等诸多问题,我们拟采用基因工程技术改造生产菌株。通过对已克隆△~9脂肪酸脱饱和酶基因的分析,合成一组简并引物,PCR扩增了被饱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因的保守区。结果表明被抱霉△9脂肪酸脱饱和酶基因保守区由537个核苷酸组成,共编码179个氨基酸。其与迄今为止发表的微生物面△9脂肪酸脱饱和酶基因有很高的同源性。这是被饱霉△~9脂肪酸脱饱和酶基因研究的次次报道。     

茄科雷尔氏菌脂酰CoA脱饱和酶和环丙烷脂肪酸合成酶的鉴定

茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种危害严重的土传植物致病菌,其宿主范围广泛,在世界各地严重影响重要经济作物的生产.研究茄科雷尔氏菌的生理特性,探索其致病机理,有利于研发防治青枯病的技术与方法.脂肪酸是细菌细胞重要的组成物质,但是茄科雷尔氏菌脂肪酸合成的机制尚不清晰.本文以茄科雷尔氏菌GMI1000为材料,鉴定了该菌的脂酰Co A脱饱和酶和环丙烷脂肪酸合成酶,并分析了这两种酶在不饱和脂肪酸和环丙烷脂肪酸合成中的作用.结果显示,茄科雷尔氏菌RSc2450编码脂酰Co A脱饱和酶,参与其不饱和脂肪酸合成,但是该菌还存在其他不饱和脂肪酸合成途径.同时发现在茄科雷尔氏菌编码两个可能的环丙烷脂肪酸合成酶蛋白质中,仅有Cfa1(RSc0776)参与了该菌环丙烷脂肪酸的合成,并在低p H和高渗透压的耐受中起作用.该研究结果为深入研究茄科雷尔氏菌脂肪酸合成代谢特点及致病机理奠定了基础.     

无细胞蛋白质合成系统的研究进展

无细胞蛋白质合成系统是一种以外源mRNA或DNA为模板 ,通过在细胞抽提物的酶系中补充底物和能源物质来合成蛋白质的体外系统 .与传统的体内重组表达系统相比 ,体外无细胞合成系统具有多种优点 ,如可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸 (如D 氨基酸 )的特殊蛋白质 ,能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质 ,开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究等 .本文综述了无细胞蛋白质合成系统的发展历史、系统中合成蛋白质所需的能量供应、遗传模板的稳定性和微型无细胞生物反应器等多方面的研究 ,并探讨了无细胞蛋白质合成系统中存在的难点、研究方向和广泛的应用前景     

高山被孢霉△5脱饱和酶基因的分离与验证

花生四烯酸（arachidonic acid）是人体的必需脂防酸,具有独特的生物活性。△5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径上的关键酶,以二高-γ-亚麻酸为底物,催化其第5位碳脱氢形成花生四烯酸。从花生四烯酸高产菌株高山被孢霉M6（Mortierella alpina）中通过RT—PCR分离了可能的编码△5脱饱和酶完整的cDNA,其大小为1366bp,编码446个氨基酸。推导出的蛋白质含有△5脂酰脱饱和酶中保守的特征性结构域,包括该蛋白质N端典型的细胞色素b。结构域,以及3个保守的组氨酸盒。为验证该蛋白质的功能,将该基因片段克隆到穿梭表达载体pPIC9K中,获得的重组载体pPIC9K-D5通过电转化法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,利用G418耐受度筛选出高拷贝数的酵母转化子,在加入外源底物二高-γ-亚麻酸时,利用甲醇诱导酵母转化子表达外源基因。酵母转化子的油脂的气相色谱图谱中出现了一个花生四烯酸的特征峰,进一步对该峰进行气质联谱（GC—MS）分析,证实该峰是花生四烯酸。研究结果表明,从高山被孢霉M6中分离出△5脱饱和酶基因。     

无细胞蛋白质合成的研究进展

无细胞合成生物学作为新兴的多学科交叉手段,已很好地应用于蛋白质工程领域。因为无细胞生物合成系统无需完整的活细胞,在体外就可激活转录和翻译机器,因此,可减少对细胞的依赖性,从而增加工程的自由度。无细胞系统的这些优点使它已经成为强大的蛋白质工程平台,用于膜蛋白和医药蛋白的合成、非天然氨基酸的嵌入以及高通量分析。无细胞蛋白质合成系统不仅在基础科学研究而且在工业化生产中拥有广阔的应用前景。本文中,笔者系统综述了无细胞蛋白质合成系统的研究及应用,并展望了该系统的研究前景。     

利用PiggyBac转座子系统构建表达Δ15 Des酶活性的转基因小鼠

必需脂肪酸为人体健康和生命所必需,但机体自身不能合成,研究表明ω-3族脂肪酸对人体的生理功能有更加积极的影响。哺乳动物体内缺乏ω-3去饱和酶的基因,来自线虫Caenorhabditis elegans的Δ15-脂肪酸去饱和酶(Δ15Des)可以将体内ω-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)转化为ω-3 PUFAs。利用PiggyBac转座子(PB)系统构建表达Δ15 Des酶活性的转基因小鼠可以在较短时间内繁育出稳定遗传的纯合子转基因小鼠,整合率高达35.1%。饲料中添加6%ω-6 PUFAs饲喂小鼠,通过气相色谱(gas chromatography, GC)检测小鼠体内脂肪酸的变化,荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)来检测Δ15 Des在小鼠体内的表达水平。从qPCR和GC结果分析,阳性小鼠的基因活性率为61.53%,与传统方法相比,Δ15 Des的转入效率及活性都显著提高,且纯合子比杂合子表达更高的活性,进一步验证了PiggyBac转座子系统高效...     

实时PCR分析△5脱饱和酶在花生四烯酸合成中的作用

花生四烯酸是人体的必需脂肪酸,具有独特的生物活性。 Δ5脱饱和酶是花生四烯酸生物合成途径中催化二高-γ-亚麻酸脱饱和为花生四烯酸的酶。本研究通过实时定量PCR技术,检测了Δ5脱饱和酶在不同花生四烯酸产量的高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株M10,M6和M23中的mRNA表达水平,以及在高产花生四烯酸菌株M6培养过程中的mRNA表达水平的动态变化,发现Δ5脱饱和酶基因的mRNA表达水平与花生四烯酸的产生之间存在明显的线性关系,表明Δ5脱饱和酶是高山被孢霉中花生四烯酸合成途径中起到了非常重要的作用。