骨骼肌特异表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因载体的构建与验证

根据猪α-actin基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到α-actin 5'调控序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-AF,小鼠股四头肌注射该重组载体,RT-PCR检测证明...     

猪IGF-Ⅰ基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的:建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。方法:根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。结果:由pMD-18T IGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102~1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠。结论:成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线。     

骨骼肌特异表达载体的构建与验证

目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性.方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1 - SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT - PCR检测证明其表达有效性.结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT - PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录.结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础.     

猪肌肉生长抑制素RNA干涉载体的构建与验证

目的:构建针对猪肌肉生长抑制素mRNA的RNA干涉载体,并体内验证其有效性。方法:分别体外转染化学合成4个19 bp的siRNA片段获取针对肌肉生长抑制素的序列,构建RNA干涉载体,将上述载体注射到猪股四头肌中,RT-PCR检测证明其表达有效性及生肌调节因子mRNA水平的变化。结果:获得了针对肌肉生长抑制素的2个小干涉RNA序列,构建了2个重组载体,股四头肌注射混合后的等量重组载体,RT-PCR显示注射重组RNA干涉载体可显著降低肌肉生长抑制素的mRNA水平(约降低了40%),生肌调节因子mRNA水平显著上调(分别约为对照组的2.1～3.9倍)。结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础。     

猪IGF-I基因荧光定量PCR标准曲线的建立

目的建立用荧光定量PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.方法根据自己克隆的猪IGF-Ⅰ(GenBankNo.DQ784687)基因mRNA序列,设计合成引物和探针,采用Taqman探针荧光定量RT-PCR的检测方法,构建检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.结果由pMD-18TIGF-Ⅰ所构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含1×102～1×106拷贝猪IGF-Ⅰ基因分子时,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系)、灵敏度高(可检测出低于10个拷贝/μL的样品)、特异性强、准确可靠.结论成功构建了用荧光定量RT-PCR方法检测猪IGF-Ⅰ基因表达量的标准曲线.