抗结核分枝杆菌RpfB结构域单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗结核分枝杆菌Rpf B结构域单克隆抗体。方法:将p PRO-EXHT-Rpf B domain原核表达载体接种于大肠杆菌DH5中,用IPTG诱导表达Rpf B结构域蛋白,以纯化的Rpf B结构域蛋白作为免疫原,皮下包埋免疫小鼠3次,每次间隔2周;分离小鼠的脾细胞,与Sp2/0细胞融合,克隆化制备抗Rpf B结构域单抗,ELISA检测其效价,鉴定其特异性和相对亲和力,观察制备的抗Rpf B结构域单抗对Rpf家族其他蛋白的识别能力及其对结核分枝杆菌和藤黄微球菌的生长抑制作用。结果:制备了3株抗Rpf B结构域单抗,特异性高,亲和力较强,均能特异性识别Rpf B结构域。经小鼠腹腔注射制备腹水并纯化,获得了较高纯度的单抗,所制备的抗Rpf B结构域多肽的单克隆抗体可以识别多种Rpf样蛋白及其结构域蛋白。在抗体滴度为1∶1000时可有效抑制Rpf B结构域对结核分枝杆菌H37Ra和藤黄微球菌的生长促进作用,提示抗Rpf B结构域单抗可能会抑制进入机体内生长停滞或潜伏感染的结核分枝杆菌的再次激活,可能具有预防隐性感染复发的作用。结论:抗Rpf B结构域单抗的制备为进一步研究Rpf B结构域的生物学和免疫特性提供了实验工具。     

活化相关分泌蛋白1单克隆抗体的制备及其在保守结构域鉴定中的应用

目的:制备重组活化相关分泌蛋白1(ASP-1)的单克隆抗体,并用其鉴定保守结构域。方法:用原核表达并纯化的重组ASP-1不加佐剂免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术及有限稀释传代法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水后用间接ELISA进行抗体特异性鉴定和效价检测,利用肽结合ELISA和Western印迹鉴定单抗识别的保守结构域。结果:获得5株能稳定分泌抗ASP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,且5株单抗的识别区域均为21~28氨基酸残基的保守性结构域。结论:制备了抗ASP-1的单克隆抗体,为深入研究ASP-1佐剂的活性功能区及作用机制提供了有效工具。     

Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

目的:筛选能特异识别vasorin(VASN)蛋白的单链DNA(ss DNA)适配体并对其进行鉴定。方法:利用SPRSELEX技术筛选VASN蛋白特异ss DNA适配体,通过基因克隆测序、MEME在线软件和RNA structure软件分析富集文库序列并挑选出候选适配体序列,利用EMSA、ELISA、流式细胞术对候选适配体进行特异性与亲和力鉴定。结果:经过5轮SELEX筛选,获得了与VASN蛋白特异结合的ss DNA适配体富集文库,合成候选适配体,经EMSA和ELISA检测分析,证实适配体V4-2能与VASN蛋白特异结合,而不与无关对照牛血清白蛋白结合,其平衡解离常数为281.3±103.7 nmol/L;流式细胞术证实V4-2能够特异识别高表达VASN蛋白的Hep G2细胞。结论:筛选获得特异识别VASN蛋白的ss DNA适配体V4-2。     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

禽网状内皮组织增殖病病毒gp90蛋白单克隆抗体的制备及其识别区分析

为了制备禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)gp90蛋白的单克隆抗体,应用His-gp90融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过筛选、3次亚克隆后获得3株稳定分泌抗REV-gp90蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为3G5-B8、3G5-A10和1G12。经间接ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法检测,单克隆抗体的亲和力解离常数(Kd)分别为6.483×10–10、4.844×10–10和9.330×10–10,3株单抗的亚型分别为Ig G1、Ig G1和Ig G2b。经Western blotting和间接免疫荧光实验检测,3株单抗均能识别REV感染DF-1细胞后产生的gp90蛋白。以Western blotting方法利用单抗检测不同截短的gp90蛋白,初步确定3G5-B8和3G5-A10 2株单抗抗原识别区均位于gp90蛋白第200-245位氨基酸,而1G12株单抗识别区包含第230-235位氨基酸。这些单抗为REV的诊断和致病机理研究奠定了基础。     

抗人IgG和抗人IgM单克隆抗体的特性鉴定及应用

目的:制备特异性高的抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体,并应用于临床血清学检测试剂盒,为其提供优质的二抗。方法:以人Ig G和Ig M为抗原,免疫BALB/c小鼠,通过传统杂交瘤融合和筛选技术制备抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体;经体内诱生法制备腹水并纯化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹进行交叉筛选和特异性鉴定,并对筛选出的单抗进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,再与市售的检测病原微生物抗体试剂盒中对应的HRP标记的二抗(抗人Ig G和抗人Ig M)做对比分析。结果:筛选到2株可稳定分泌抗人Ig G单抗和2株抗人Ig M单抗,经交叉反应、Western印迹及对比实验分析,证明这4株单抗效价高、特异性好,比临床试剂盒中的酶标二抗特异性强、敏感度高。结论:获得4株特异性强、敏感度高的抗人Ig G和抗人Ig M单克隆抗体,可为各种病原微生物血清学的检测提供二抗试剂,具有良好的应用价值。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

VT2-B亚单位的重组表达及单克隆抗体的制备

以大肠杆菌O157DNA为模板扩增VT2-B亚单位,纯化后经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切,连入表达载体pGEX4T-2,构建重组表达质粒pGEX4T-2-VT2-B。转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了VT2-B-GST融合蛋白的可溶性表达,表达量约占菌体总蛋白的35%。重组蛋白纯化后,免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体,得到2株融合细胞,制备了腹水单抗,测得单抗的ELISA效价为104。Western blot表明,该单抗能与重组蛋白特异性的结合。特异性单抗的获得为VT2毒素检测方法的建立奠定了基础。     

OAS1蛋白单克隆抗体的制备及其表征

目的:用OAS1蛋白免疫小鼠,获得OAS1特异性单克隆抗体,为OAS1的含量测定提供基础。方法:通过全基因合成的方法获得目的基因序列,转化大肠杆菌BL21细胞诱导His-OAS1及OAS1蛋白表达,纯化后用作抗原免疫小鼠,取脾融合,筛选稳定分泌抗体的阳性细胞株,制备并纯化单抗,通过SDS-PAGE,ELISA,Western blot等方法进行检测。结果:体外高效表达OAS1蛋白,并成功制备特异性单克隆抗体,效价在5×10^-11mol/L以上,亲和常数为3.37×10⁸ L·mol^-1。结论:获得高亲和力OAS1单克隆抗体,为其含量的检测奠定了基础。     

人突触囊泡蛋白2C单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备人突触囊泡蛋白2C(SV2C)单克隆抗体。方法:纯化SV2C/L4蛋白,免疫BALB/c小鼠并制备杂交瘤细胞,筛选针对SV2C/L4的特异性抗体,鉴定亚型及测定效价;选取效价最高的抗体进行大量制备,并经SDSPAGE、Western印迹、间接ELISA和动物实验对抗体纯度、特异性、亲和力及中和活性进行检测。结果:得到纯度大于95%的SV2C/L4蛋白,经2轮筛选共获得13株鼠单抗,抗体重链大多为IgG1、IgG2a型,轻链均为κ型;选取效价最高的30号抗体进行大量制备,纯化后抗体的纯度大于99%,亲和力为6.7 nmol/L,中和活性为100 LD50/mg。结论:筛得1株高亲和力、具有中和活性的特异性SV2C鼠单抗,为肉毒中毒的治疗提供了新的选择,也为阐明Bo NT/A受体间的关系奠定了基础。     

抗人线粒体核糖体小亚基蛋白17单克隆抗体的制备和鉴定

以纯化人线粒体核糖体小亚基蛋白17(MRPS17)免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和ELISA法筛选成功获得1株抗MRPS17杂交瘤细胞。以所获特异性单抗作为一抗,使用Western印迹、免疫组化和免疫荧光等方法检测标本中MRPS17。结果显示:Western印迹检测人骨骼肌组织、黑素瘤组织和体外培养HeLa细胞提取蛋白质,在分子量约13kDa处有一特异性条带,与阳性对照纯化MRPS17相一致;免疫组化检测石蜡切片标本显示人骨骼肌细胞和恶性黑素瘤细胞胞浆中强阳性着色;细胞免疫荧光检测于培养的HeLa细胞,可见细胞核周围胞浆部位颗粒状绿色荧光,其分布与线粒体特异性荧光探针(MitoTrackerRedCM-H2XRos)的荧光分布一致。说明成功制备了具有高度特异性并可适用于多种检测方法的抗人MRPS17单抗,应用该单克隆抗体对人MRPS17进行了亚细胞水平定位,为线粒体生物学相关研究提供了新的研究工具。     

传染性法氏囊病病毒VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性法氏囊病病毒(IBDV)蛋白VP4在抑制宿主免疫应答中起重要作用,为制备IBDV VP4的单克隆抗体,以实验室保存的融合蛋白His-VP4免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、筛选、亚克隆后获得4株能稳定分泌抗VP4的单抗杂交瘤细胞株,分别命名为3B3、3H11、4C8和4G6,经间接ELISA测定4株单抗的亲和力解离常数分别为4.61×10–11、1.71×10–10、4.26×10–11和5.02×10–11,均为高亲和力抗体。4株单抗的重链类型分别为Ig G1、Ig G1、Ig G2b和Ig G1。进一步以Western blotting鉴定,该4株单抗均能特异地识别IBDV的VP4蛋白,间接免疫荧光和Western blotting试验表明4株单抗均能识别IBDV感染DF-1细胞后产生的VP4蛋白。该单抗为检测IBDV以及研究IBDV VP4的生物学作用奠定了基础。     

HBV前S2蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

目的克隆表达HBV前S2蛋白,用纯化的重组蛋白GST-S2免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗HBV前S2蛋白的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法利用含双拷贝乙肝病毒adw2亚型基因全序列的质粒pEcob6,经PCR方法扩增出HBV前S2片段,在GST表达系统中表达,表达产物用谷胱甘肽亲和层析纯化后,用于免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗前S2蛋白的mAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力.结果获得一株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞7A6;相对亲和力均在107以上.Western blot显示该株mAb能特异识别重组前S2蛋白.结论成功地制备出抗HBV前S2蛋白的一株mAb.     

Tau蛋白外显子特异性单抗制备及初步应用

目前由于缺失特异性的商品化抗体,不同tau异构体在中枢神经系统疾病中,尤其在朊病毒病中的变化鲜有报道。本研究利用杂交瘤技术制备了抗tau蛋白外显子2和10的单克隆抗体,同时对制备抗体的灵敏度、特异性、免疫反应亲和力、种属反应性等方面进行了评价,随后对制备的抗体应用范围进行了摸索。结果显示,制备的四株单抗特异性高、灵敏度好,尤其可以识别小鼠脑组织中的tau蛋白。制备的四株单抗可用于间接细胞免疫荧光实验和多种感染神经细胞和感染小鼠模型脑组织的蛋白免疫印迹和免疫组织化学实验。综上,本研究制备了四株tau外显子特异性单抗,上述单抗具有较广的应用范围,将成为神经退行性疾病中tau蛋白检测的有力工具。     

抗羊口疮病毒ORFV118蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及其应用

制备抗羊口疮病毒118(ORFV118)重组蛋白的单克隆抗体并鉴定其生物学特性。构建ORFV118原核表达重组质粒pET33b-ORFV118,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,诱导表达出ORFV118重组蛋白;利用Ni-NTA亲和层析法纯化ORFV118重组蛋白;以纯化蛋白为抗原免疫小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体;利用间接ELISA法、Western blot、免疫组化等方法分别对单抗特异性、效价、亚型以及ORFV118蛋白的功能进行研究。获得了3株稳定分泌单克隆抗体的细胞株,分别命名为1A2,3B5,5D10,它们诱生的小鼠腹水效价分别为110 000,16 400,18 000。其中效价最高的1A2抗体亚型为IgG1,能特异性结合其免疫原蛋白、真核表达产物以及病羊皮肤组织中的ORFV118蛋白。免疫组化结果显示单抗1A2染色局限于皮肤表皮层角化细胞及浸润至皮下组织的炎症细胞,与病毒侵染上皮组织层的特性相符。制备的单抗1A2能特异性识别ORFV118。深入研究单抗1A2将为了解ORFV118的生物学特性,为羊传染性脓疱病的诊断、预防与治疗提供可能和新思路。     

Asia Ⅰ口蹄疫vp2蛋白单克隆抗体的制备及单抗竞争ELISA方法的建立

制备Asia Ⅰ口蹄疫病毒vp2单克隆抗体(mAb)并建立了单抗竞争ELISA方法.用纯化的Asia Ⅰ型口蹄疫病毒vp2重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞.分别用ELISA、Western blotting检测mAb腹水的效价及其特异性.筛选到杂交瘤细胞2株,腹水效价均在100×2<'9>以上:以纯化后的AsiaⅠ型口蹄疫病毒vp2重组蛋白作为抗原,利用Asia Ⅰ型口蹄疫病毒vp2单抗酶标物建立了竞争ELISA方法用来检测Asia Ⅰ型口蹄疫抗体.临床应用表明,该方法与UBI公司的口蹄疫全病毒抗体检测试剂盒总符合率达89.0%,和荷兰赛迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒总符合率达86.5%.     

抗鸡白细胞介素4单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备鸡白细胞介素4(chIL-4)单克隆抗体,将成熟的chIL-4基因亚克隆至原核表达载体pET-28a和pGEX-6P-1上,然后在大肠杆菌中分别诱导重组蛋白His-chIL-4和GST-chIL-4的表达,并纯化。将纯化后的His-chIL-4作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将纯化后的GST-chIL-4作为筛选抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗chIL-4蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H。经ELISA检测,3株单克隆抗体的亚型均为IgG1,亲和力解离常数(Kd)分别为1.79×10~(–9)、1.61×10~(–9)和2.36×10~(–9)。经Western blotting及间接免疫荧光试验鉴定,3株单克隆抗体均能特异性识别原核和真核表达的chIL-4蛋白。Western blotting试验证明1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H识别的抗原表位区域分别为chIL-4蛋白N端的第1–40、80–112和40–80位氨基酸。该单克隆抗体的制备为chIL-4的检测和生物学功能研究奠定了基础。     

抗登革病毒NS1单抗的制备及检测NS1方法的建立

制备抗登革病毒NS1蛋白单克隆抗体,建立检测NS1的ELISA方法。表达1~4型登革病毒NS1蛋白,将1型NS1蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体。经ELISA、Western blotting、间接免疫荧光筛选和鉴定单克隆抗体,进行纯化和HRP标记。通过鉴定每两株单抗之间是否存在竞争作用,选择非竞争单抗组合并建立NS1捕获法ELISA。结果获得7株高滴度抗NS1单抗,捕获法ELISA可以检出10ng/mL NS1。原核表达登革病毒NS1蛋白制备的单抗可以和天然病毒抗原反应,NS1捕获法ELISA可以用于登革病毒感染检测。     

Asia I口蹄疫vp2蛋白单克隆抗体的制备及单抗竞争ELISA方法的建立

制备Asia I口蹄疫病毒vp2单克隆抗体(mAb)并建立了单抗竞争ELISA方法。用纯化的Asia I型口蹄疫病毒vp2重组蛋白免疫BALB/c小鼠, 将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合, 采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞。分别用ELISA、Western blotting检测mAb腹水的效价及其特异性。筛选到杂交瘤细胞2株, 腹水效价均在100×29以上; 以纯化后的Asia I型口蹄疫病毒vp2重组蛋白作为抗原, 利用Asia I型口蹄疫病毒vp2单抗酶标物建立了竞争ELISA方法用来检测Asia I型口蹄疫抗体。临床应用表明, 该方法与UBI公司的口蹄疫全病毒抗体检测试剂盒总符合率达89.0%, 和荷兰赛迪公司的口蹄疫病毒LPB-ELISA抗体检测试剂盒总符合率达86.5%。     

人源抗狂犬病毒中和性全抗体在昆虫细胞中的表达

将来源于噬菌体抗体库的人源狂犬病毒糖蛋白特异性单抗G10Fab的基因 ,克隆入杆状病毒人源IgG抗体表达载体 ,通过转染将重组质粒导入昆虫细胞 ,以全抗体的形式表达了一株人源抗狂犬病毒基因工程抗体G10。用亲和层析的方法纯化了表达产物 ,经与一株鼠源糖蛋白特异性单抗竞争证实 ,该单克隆抗体特异性识别狂犬病毒糖蛋白 ,亲和力约为 10 -9M。体外中和实验证明 ,该单抗对狂犬病毒aG株具有体外中和活性