吸水链霉菌井冈变种的色素合成基因缺失对井冈霉素产量的影响北大核心CSCD

【目的】通过缺失井冈霉素高产菌株TL01中4个典型的色素合成基因簇来考察其对井冈霉素产量、菌体生长和发酵液颜色的影响。【方法】通过同源重组双交换对4个色素合成基因簇进行逐个同框缺失,HPLC检测突变株井冈霉素产量的变化,q RT-PCR检测突变株中井冈霉素合成基因转录变化,通过称量菌丝体干重来绘制其生长曲线。【结果】和出发菌株TL01相比,多巴类黑色素基因簇缺失株PY06中井冈霉素的发酵产量由原来的20.6 g/L上升至23.1 g/L,提高了12%;III型聚酮合酶编码的黑色素基因簇缺失株PY07产量无明显变化;II型聚酮合酶编码的孢子色素基因簇缺失和褐黄素基因簇缺失分别导致井冈霉素产量下降11.7%和17.2%。所有缺失突变株中井冈霉素基因簇转录水平和发酵液颜色均没有明显变化。【结论】不同色素基因的缺失对井冈霉素产量和菌株生物量积累具有不同的影响。多巴类黑色素与井冈霉素的生物合成过程竞争共同前体,将其中断后使前体流向井冈霉素生物合成,达到了进一步提高产量的目的。     

井冈霉素产生菌的选育

井冈霉素对水稻纹枯病具有较好的防治效果。由于原始菌种发酵单位较低,几年来我们对该菌进行了大量的选育工作,并研究了变异菌株的最适发酵条件,使发酵单位大幅度提高,成本下降,基本满足了生产需要。现将井冈霉素产生菌的选育工作简报如下。     

N+注入诱变选育菜粕硫苷降解菌的研究

为选育能够高效降解菜粕硫苷( Glucosinolates,Gls)的菌株,利用能降解硫苷的益生菌黑曲霉CICC-2238进行N+注入诱变.经过两次N+注入诱变,在诱变能量为20 keV,剂量为60 ×2.5×1013ions/cm2时,筛选到一株高效降解Gls的菌株H-109.与出发菌相比较,其Gls的降解率由28....     

低能离子注入诱变选育漆酶高产菌株

利用低能N+束注入技术对漆酶产牛菌灵芝菌(Ganoderma lucidum)U60菌丝体进行辐照诱变.通过研究15 keV能量下不同注入剂量与灵芝菌存活率及突变率的生物学效应关系,确定了在2.6×1015-3.9×1015ions/cm2注入剂茸范围内可获得高比例正突变株.选择3.12×1015ions/cm2的注入剂量参数后,经多轮注入诱变,获得了遗传性稳定的漆酶高产突变株UIM-281;发酵产酶实验表明,UIM-281的产漆酶活力峰值分别是出发菌株U60的1.7倍及2.28倍,且产酶发酵周期相对缩短24 h,是工业发酵中更加经济高效的灵芝漆酶发酵菌株.     

低能离子束诱变选育阿魏菇多糖高产菌株

利用低能离子注入,对阿魏菇菌丝体细胞采用在15Kev的注入能量下注入不同的剂量,经斜面培养,液体发酵后,通过初筛、复筛后,确定了最佳注入剂量9×1014N+/cm2.并筛选出一株多糖高产菌株GC-1.其多糖含量较对照提高了35%.     

诱变选育雄烯二酮高产菌株及其发酵条件研究

以一株降解植物甾醇产生雄烯二酮的分枝杆菌为研究对象,先后利用亚硝基胍(NTG)和N+注入技术对其进行诱变处理。通过考察NTG浓度和N+注入剂量对菌株诱变效果的影响,确定了最佳诱变条件为NTG浓度为0.6 mg/mL,N+注入剂量为60×1011ions/cm2。最终选育出一株高产突变株Mycobacterium sp.N-2,其生产雄烯二酮的能力较出发菌株提高了37.8%,且传至第七代仍基本稳定。进一步研究了初始pH值、接种量和摇床转速等对高产突变菌株发酵能力的影响,确定了最佳发酵条件为初始pH值7.5,接种量12%,摇床转速260 r/min。     

梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变筛选模型的初步研究

本文通过梅岭霉素 (Meilingmycin)产生菌南昌链霉菌NS 4 1 80菌株孢子对 6种抗生素敏感性测定 ,采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株孢子进行诱变处理 ,诱变处理的孢子涂布在含致死浓度链霉素的高氏平板上。然后从抗药性突变标志菌株中进一步筛选梅岭霉素高产菌株。在 150 0多个抗药性突变株中通过初筛获得了比诱变出发菌株的产素能力提高 50 %以上菌株。通过诱变剂量分别与抗药性突变率和突变株产素产量的变势统计分析表明 ,菌株抗药性突变与产素突变密切相关 ,产素突变的EMS诱变剂量高于抗药性突变诱变剂量 ,在 0 .0 3mol/LEMS剂量作用下 ,菌株致死率为 99.4 3% ,抗药性突变率为 0 .0 4 4 0 % ,建立了梅岭霉素产生菌抗药性突变标志诱变推理性筛选模型。为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试 ,并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

离子束注入提高Trichosporon lactis T立体拆分布洛芬水平的研究

以从土壤中分离筛选到的可立体选择性水解布洛芬乙酯生成S-布洛芬的菌株Trichosporon lactisT为出发菌株,对其进行能量30KeV,剂量1×1015~5×1015ions/cm2的低能N 注入,筛选立体选择性水解布洛芬乙酯活性高的诱变株。菌株T.lactisT,在4×1015ions/cm2的诱变剂量下突变率最高,正向和负向突变率分别达32.9%和37.1%,因此选定该剂量为T.lactisT的最佳N 离子注入剂量。经离子束诱变,通过初筛和复筛,共筛选到7株水解布洛芬乙酯的高产菌株,其中诱变株K1培养24h时酶活力比出发菌株T高50%,且具有较好的遗传稳定性。将菌株K1和出发菌株T培养24h,分别加入布洛芬乙酯水解24h,二者水解布洛芬乙酯生成S-布洛芬旋光度均为 54.1°,对映体过量值ee%均为98%,K1菌株水解的产量达6.96g/L,而出发株仅为4.24g/L。     

井冈霉素研究概况(综述)

对井冈霉素的生产、应用、检测技术和作用机理等方面的研究进展进行综述,并就未来井冈霉素的研究方向提出建议。     

井冈霉素土法生产工艺

为了适应农业生产的需要,使井冈霉素能在各地农村土法上马。我们与有关生产单位共同协作摸索出了井冈霉素土法生产工艺。经生产实践证明这种方法是可行的。现将土法生产方法介绍如下:     

蛋白激发子PeaT1与井冈霉素混合使用诱导烟草对TMV抗性的研究

烟草病毒可侵染危害烟草、番茄、辣椒和土豆等多种作物导致病毒病发生,是生产上难以防治的病害。为了探索蛋白激发子Pea T1与井冈霉素混合使用对烟草病毒病防治的最佳混配比例,本研究选用3-7片真叶的本生烟(Nicotiana benthamiana cv.Huangmiaoyu),分别喷施清水、井冈霉素、蛋白激发子Pea T1及蛋白激发子Pea T1-井冈霉素复合制剂,采用摩擦接种的方式接种TMV-GFP病毒,在紫外光下观察病毒的侵染情况。结果表明,喷施了井冈霉素和蛋白激发子复合制剂的本生烟对TMV的抗性较单剂具有增效作用,其中蛋白激发子Pea T1-井冈霉素按3:4混配的性价比最高,共毒系数达到157.64,相对防效为73.39%。这说明井冈霉素和蛋白激发子Pea T1都能使烟草产生对TMV的系统获得抗性,而其复合制剂更有着叠加效应。     

氮离子注入诱变选育恩拉霉素高产菌株

利用氮离子注入对链霉菌的诱变效应,筛选高产恩拉霉素的变异菌株。利用不同剂量的氮离子对杀真菌放线菌S.fungicidicus NL629-3菌株进行诱变处理,研究低能氮离子注入对其存活率及产恩拉霉素能力的影响。低能氮离子注入剂量在60×1013ions/cm2时对链霉菌的诱变效应显著,试验得到了5株恩拉霉素产量较高的突变菌株,其中N3-643菌株经连续传代4次,遗传稳定性较好,其摇瓶发酵水平较对照提高了41%,放大发酵生产后平均发酵水平提高25.8%。离子注入诱变是获得高产恩拉霉素突变菌株的有效方法。     

N+注入选育产蛋白酶益生菌及其生物学效应研究

试验研究了N+注入选育产蛋白酶益生菌及其生物学效应.经N+反复注入诱变筛选,突变高产菌株的酶活由出发菌株的75.8IU.g-1提高到631.6IU.g-1;利用中心组合设计原理摸索出了突变菌株最佳产酶条件即麸皮24.83%,豆粕23.68%,水50%,硫酸铵1.49%,发酵温度30℃,发酵时间66h,培养基pH 5.5.生物学效应研究发现真空处理对活细胞有明显伤害;孢子存活率先是随着注入剂量加大而迅速降低,当注入剂量加大到50×2.6×1013 ions/cm2时存活率出现平缓回升,注入剂量超过100×2.6×1013ions/cm2时存活率又再次开始下降;注入剂量越大,孢子突变率越高,中等注入剂量30×2.6×1013N+/cm3～80×2.6×1013N+/cm2可引起较高的正突变率;ESR谱研究结果表明,N+注入前和注入后都有自由基ESR波谱单一峰,随着注入剂量的增大,孢子内的自由基ESR波谱的强度也逐渐增大;SEM观察发现,未经N+注入的孢子较为完整、饱满且表面光滑,而经注入后的孢子表面粗糙,可见明显的刻蚀损伤和破壁现象,并且注入剂量越大,伤痕也越深宽.试验结果提示N+注入是一种有效的动物益生菌选育方法.     

庆丰链霉菌SQP1质粒的种间转移和表达

庆丰链霉菌A201菌株的SQP1质粒可以通过混合培养接合转移到井冈链霉菌VA4菌株的细胞中,转移频率为2—8％。接合子p菌株的形态特征和亲株VA4相似,但却获得了产生抑制细菌的抗生素的能力,这种抑制细菌的能力在遗传上是稳定的。高温预培养能使接合子P2菌株抑细菌活性受到消除,消除频率达10％以上。鉴定P2接合子的发酵产物证明包含二个抗菌物质,一个是它本来的产物井冈霉素,另一个是新获得的抑制细菌物质庆丰霉素,后者的产生是由于SQP1进入新寄主细胞的结果。     

低能离子注入木聚糖酶产生菌黑曲霉(Aspergillus Niger)育种中参数的优化

本文对离子束技术的注入工艺和在不同能量下的不同注入剂量下黑曲霉的存活率和突变率进行了研究,目的是为了找到恰当的注入工艺和良好的注入参数,使诱变达到较好的效果。结果发现:当注入离子为氮离子时,在10keV的能量下注入剂量为5.2×1014ions/cm2和1.56×1015ions/cm2时,诱变效果较好。在这注入条件下,通过培养基优化,使木聚糖酶酶活达到600IU/ml。     

低能离子修饰多不饱和脂肪酸产生菌株的研究北大核心CSCD

为得到多不饱和脂肪酸高产菌株,通过氮离子注入产油粘红酵母(Rhodotorula glutinis),对其进行辐照诱变,发现当注入能量为10 keV时,注入剂量80×2.6×1013ion/cm2为最佳诱变参数。然后,采用含有脂肪酸合成酶抑制剂cerulenin的培养基对高产油脂粘红酵母进行初筛,并研究了cerulenin对粘红酵母细胞的抑制作用,结果表明,当cerulenin的浓度达到11.20×10-6mol/L时,抑制率为90%,可以作为筛选浓度,利用酸热耦合超生波法和索氏抽提法验证了cerulenin筛选菌株的准确性。最终筛选出一株油脂产量比出发菌株提高32%的高产菌株D30,经多次传代实验表明,该菌株遗传稳定性较好。气相色谱分析其油脂组成,结果表明多不饱和脂肪酸含量为28.07%。     

基于转录组分析的染色体大片段缺失及其对井冈霉素高产菌株的影响

【目的】测试大片段删减低转录区域对菌体生长和井冈霉素产量的影响。【方法】通过转录组分析,选择染色体上连续的基因低转录区域进行大片段缺失,通过Cre-loxP位点特异性重组得到1.2 Mb片段缺失突变株LCY-4。HPLC检测缺失株井冈霉素产量的变化,并测定干重绘制生长曲线。【结果】通过转录组分析,我们在井冈霉素高产菌株TL01染色体左侧末端发现了1.9 Mb的连续基因低转录区,使用Cre-loxP系统对其中的1.2 Mb区域进行大片段缺失,成功得到了1.2 Mb缺失突变株LCY-4。和出发菌株TL01相比,缺失突变株LCY-4中井冈霉素发酵产量基本保持不变,生物量有显著提高,最高增幅达到44%。【结论】1.2 Mb区域的成功缺失,意味着基于转录组分析寻找连续的基因低转录区域并加以缺失的策略的可行性。1.2 Mb片段缺失对菌体生物量积累具有明显促进作用,为后续将其开发成氨基环醇类药物异源表达的通用高产宿主奠定了基础。     

N~+离子注入选育高产氨基酰化酶菌株的研究

选用N~+离子注入的方法对米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 2339-1进行诱变育种,通过三角瓶发酵法筛选氨基酰化酶高产株。N~+离子注入选择能量为10 KeV,剂量在(1.30～4.94)×10~(15)ions/cm~2之间。根据剂量与存活率以及剂量与突变率曲线选择最佳的注入剂量。通过三角瓶发酵筛选得到突变菌株SN-110-15其酶活提高率为139.5%,诱变试验效果显著。     

离子束注入提高Trichosporon lactis T立体拆分布洛芬水平的研究

以从土壤中分离筛选到的可立体选择性水解布洛芬乙酯生成S布洛芬的菌株Trichosporon lactis Ｔ为出发菌株,对其进行能量30KeV,剂量1×1015～5×1015ions/cm2的低能N+注入,筛选立体选择性水解布洛芬乙酯活性高的诱变株。菌株T.lactis T,在4×1015 ions/cm2的诱变剂量下突变率最高,正向和负向突变率分别达32.9%和37.1%,因此选定该剂量为T. lactis T的最佳N+离子注入剂量。经离子束诱变,通过初筛和复筛,共筛选到7株水解布洛芬乙酯的高产菌株,其中诱变株K1培养24h时酶活力比出发菌株T高50%,且具有较好的遗传稳定性。将菌株K1和出发菌株T培养24h,分别加入布洛芬乙酯水解24h,二者水解布洛芬乙酯生成S布洛芬旋光度均为+54.1°,对映体过量值ee%均为98%,K1菌株水解的产量达6.96g/L,而出发株仅为4.24g/L。     

氮离子注入选育阿维拉霉素高产菌株的研究

以提高产绿链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)SV-1产阿维拉霉素(Avilamycin)产量为目的,采用低能氮离子注入技术,辅之以链霉素抗性筛选法进行诱变选育研究。结果表明,“马鞍”区域即注入剂量范围在3×10~(15)～5×10~(15)ions/cm~2诱变效果最佳,菌株的抗药性突变与产量突变密切相关,链霉素抗性筛选法具有可行性。在摇瓶条件下,最终获得稳定性良好,阿维拉霉素产量达到83．5mg/L,较出发菌株提高195%的突变株SVT-45。实验表明,离子注入技术是一种有潜力的微生物诱变育种新方法。