ε-聚赖氨酸高产菌选育与发酵性能评价

【目的】选育ε-聚赖氨酸(ε-PL)高产菌,并探究不同碳源对其发酵性能的影响。【方法】借助基因组重排和核糖体工程两种育种手段强化ε-PL产生菌的合成能力,并利用p H冲击工艺评价不同碳源对ε-PL发酵的影响。【结果】经过4轮基因组重排和4轮核糖体工程连续选育,获得1株高产突变株Streptomyces albulus GS114,其摇瓶ε-PL产量达到3.0 g/L,较出发菌提高了1.7倍。该改造菌株在5 L发酵罐中分别以葡萄糖和甘油为碳源进行192 h的补料-分批发酵时,ε-PL发酵产量分别达到了43.4 g/L和45.7 g/L,较出发菌提高了11.0%和14.9%,而菌体量分别减少了24.0%和33.2%,ε-PL得率提高了34.2%和30.7%。【结论】基因组重排结合核糖体工程育种是一种有效的ε-PL高产菌选育手段,研究结果将为ε-PL高产菌改造和工业生产碳源选择提供直接指导。     

链霉菌ε-聚赖氨酸发酵过程中的氧化胁迫效应

【目的】探究ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌对p H和ε-PL的耐受性、氧化胁迫与ε-PL合成之间的关系。【方法】选取3株ε-PL产生菌Streptomyces sp.AF3-44、Streptomyces sp.AS32和Streptomyces albulus F15,比较其在发酵性能、p H和ε-PL耐受性以及抗氧化胁迫能力上的差异,并对菌株发酵过程的活性氧成因进行分析。【结果】在3株菌中AF3-44具有最强的p H和ε-PL耐受性及抗氧化胁迫能力,因而在发酵后期能够保持良好的细胞活性和最高的ε-PL浓度;ε-PL引起的氧化胁迫主要发生在发酵前期,而发酵中后期氧化胁迫的产生主要由酸性p H导致。【结论】提高链霉菌ε-PL发酵过程中的抗氧化胁迫能力,可提升菌体活力和发酵水平。     

一株产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌遗传转化体系

为了更好地研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)生物合成的分子机制以及构建ε-PL高产基因工程菌株,拟建立一株ε-PL产生菌株Streptomyces albulus PD-1的遗传转化体系。通过对培养基类型、孢子预萌发处理、培养基中Mg2+浓度等条件进行考察,以Escherichia coli ET12567(p UZ8002)为供体菌,成功地将p IB139质粒导入S.albulus PD-1中。结果表明:质粒转化效率达到(3±0.4)×10-6个接合转化子/受体。接合子传代实验和PCR结果发现,p IB139质粒能够稳定整合在S.albulus PD-1染色体的att B位点上。本研究建立了一株ε-PL生产菌株的遗传转化体系,为从分子水平上研究ε-PL的合成及ε-PL高产菌株的构建奠定了基础。     

聚-ε-赖氨酸高产菌株的筛选及其发酵工艺的初步研究

利用亚甲基蓝平板初筛、摇瓶复筛,从土壤中筛选了一株聚-ε-赖氨酸(ε-PL)高产菌株,ε-PL摇瓶产量大于2g/L,经初步鉴定该菌株为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。对该菌株发酵生产ε-PL的培养基成分进行初步研究表明:葡萄糖是最好的碳源,酵母粉和硫酸铵是最佳的复合氮源,在优化培养基下,ε-PL摇瓶产量达到3.9g/L。     

聚-ε-赖氨酸补料发酵的初步研究

在5L自动发酵罐中,通过分批发酵和补料分批发酵,对白色链霉菌(Strepomyces albulus)生物合成聚-ε-赖氨酸(ε-PL)进行了初步研究。结果表明,在分批发酵中,利用pH控制策略,ε-PL产量从0.6 g/L提高到2.4 g/L。在分批补料发酵中,采用pH控制策略,当糖浓度在10g/L以下,补加葡萄糖和硫酸铵,则菌体大量生长,ε-PL产量提高到16.81 g/L,为分批培养的27倍。     

核糖体工程技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

【目的】利用核糖体工程技术选育Streptomyces albulus AS3-14的链霉素和利福平双重抗性突变株,以提高其ε-聚赖氨酸合成能力。【方法】通过链霉素抗性筛选,获得链霉素抗性的ε-聚赖氨酸产量提高突变株;在此基础上,继续筛选其利福平抗性突变株,实现链霉素和利福平双重抗性ε-聚赖氨酸高产菌选育。【结果】获得的双重抗性高产突变株Streptomyces albulus WG-608的ε-聚赖氨酸摇瓶产量达到3.7 g/L,5 L发酵罐补料分批发酵ε-聚赖氨酸产量达到53.0 g/L,较出发菌株分别提高了42.3%和32.5%。【结论】链霉素和利福平双重抗性选育能够显著提高ε-聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus的产物合成能力。     

具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株选育及生理特性

以ε-聚赖氨酸产量为1.60g/L的Streptomyces albulus M-Z18为出发菌株,利用核糖体工程技术选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株,并对高产菌株和出发菌株的生理生化性能进行比较。通过链霉素诱变成功选育出了1株遗传稳定的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus S-7,ε-聚赖氨酸产量为2.03g/L;对S.albulus S-7叠加巴龙霉素,获得1株遗传稳定的具有双重抗性的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus SP-14,ε-聚赖氨酸产量为2.37g/L,比出发菌株S.albulus M-Z18的ε-聚赖氨酸产量增加了48.10%。使用链霉素和巴龙霉素选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株是一种有效的手段。     

一株ε-多聚赖氨酸产生菌的筛选与鉴定

【目的】筛选和鉴定产ε-多聚赖氨酸(ε-polylysine,ε-PL)的放线菌菌株,测定所产ε-PL的结构和聚合度,研究其抑制微生物生长的效果。【方法】利用亚甲基蓝和ε-PL因静电排斥而形成透明圈原理筛选ε-PL产生菌,采用Itzhaki方法复筛。考察分离菌株的形态、生理生化特征和16SrRNA基因、gyrB基因序列的同源性鉴定菌种。结合其波谱特征对其所产ε-PL进行结构和聚合度鉴定。采用抑菌圈法考察所产ε-PL对7株指示菌的抑菌活性。【结果】获得3株能够产生ε-PL的放线菌,其中X-18的ε-PL产量最高,达到0.8g/L,综合形态、生理和分子生物学分析结果,鉴定为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。根据波谱学特征,并与标准品比对,证实该ε-PL分子聚合度为25–30,抑菌实验结果显示,它对细菌的抑菌效果明显好于真菌。【结论】从土壤中分离到1株抑菌效果较好的ε-PL产生菌S. albulus X-18,丰富了ε-PL产生菌资源。     

Breeding of ε-poly-L-lysine producing strain using succinic acid as sole carbon source

本文旨在通过诱变和耐受性筛选的手段提高放线菌ε-PL的产量.以稠李链霉菌Streptomyces padanus LS-L5为出发菌,经紫外诱变,在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上筛选快速生长的菌株,测定突变株的ε-PL发酵水平和遗传稳定性.经初筛和复筛,获得突变株H3,其摇瓶发酵ε-PL产量为0.68 g/L,较出发菌提高了41％,传代4次产量基本稳定.H3在5L发酵罐中分批发酵,ε-PL产量达到2.0 g/L,较出发菌提高了一倍.在固定二氧化碳的能力方面,突变株H3的PEP羧化酶酶活较出发菌株LSL5的PEP羧化酶酶活提高了1.67倍.     

以琥珀酸为唯一碳源选育ε-聚赖氨酸高产菌

本文旨在通过诱变和耐受性筛选的手段提高放线茵￡一PL的产量。以稠李链霉菌Strepto—myces padanus LS-L5为出发菌,经紫外诱变,在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上筛选快速生长的菌株,测定突变株的ε-PL发酵水平和遗传稳定性。经初筛和复筛,获得突变株H3,其摇瓶发酵ε-PL产量为0．68dL,较出发菌提高了41％,传代4次产量基本稳定。H3在5L发酵罐中分批发酵,ε-PL产量达到2．0g／L,较出发菌提高了一倍。在固定二氧化碳的能力方面,突变株H3的PEP羧化酶酶活较出发菌株LS-L5的PEP羧化酶酶活提高了1．67倍。     

Kitasatospora sp. MY5-36产ε-聚赖氨酸分批补料发酵动力学

以北里孢菌(Kitasatospora sp.)MY 5-36为供试菌株,对ε-聚赖氨酸分批补料发酵动力学模型进行研究。建立了该菌株发酵合成ε-聚赖氨酸的菌体生长、产物合成和总糖消耗的动力学模型,并通过Origin 8.1软件对模型参数进行非线性拟合。结果表明:菌体量和聚赖氨酸的产量分别为16.25和13.15 g/L,产物合成与菌体生长的关系为部分耦联型。经验证,预测值与实验值有良好的拟合性,拟合度分别为0.999、0.995和0.992,说明所构建模型能够较好地反映ε-聚赖氨酸分批补料发酵过程。     

聚-ε-赖氨酸高产菌株的筛选及其发酵工艺的初步研究

利用亚甲基蓝平板初筛、摇瓶复筛,从土壤中筛选了一株聚-ε-赖氨酸（ε-PL）高产菌株,ε-PL摇瓶产量大于2g/L,经初步鉴定该菌株为白色链霉菌（Streptomyces albulus）。对该菌株发酵生产ε-PL的培养基成分进行初步研究表明：葡萄糖是最好的碳源,酵母粉和硫酸铵是最佳的复合氮源,在优化培养基下,ε-PL摇瓶产量达到3.9 g/L。     

小白链霉菌ε-聚赖氨酸降解酶生理功能分析

[目的] 研究小白链霉菌（Streptomyces albulus）中ε-聚赖氨酸降解酶（Pld）的分布特征和生理功能。[方法] 利用生物信息学手段对已报道的ε-聚赖氨酸（ε-PL）产生菌的Pld进行挖掘和分析,再通过遗传学方法对小白链霉菌M-Z18基因组中存在的两种pld进行敲除、回补和过表达,最后研究重组菌降解ε-PL能力、最小ε-PL抑制浓度（MIC）及其合成ε-PL情况。[结果] PldⅠ和PldⅡ广泛且同时分布于小白链霉菌中,蛋白序列高度保守;PldⅠ、PldⅡ在小白链霉菌M-Z18中均能行使降解ε-PL的功能,但PldⅡ降解活性占主导地位且PldⅠ和PldⅡ对降解ε-PL具有协同作用;pldⅠ、pldⅡ过表达重组菌对ε-PL的MIC值显著提高,其中双过表达pldⅠ和pldⅡ菌株对ε-PL的MIC值是出发菌株的2.19倍。构建的pld重组菌与出发菌株相比,在考察pH值范围内（pH 3.0-5.5）的ε-PL产量未表现出显著差异。[结论] 小白链霉菌中广泛分布PldⅠ和PldⅡ且序列高度保守,主要生理功能是保护小白链霉菌在中性环境中免受自身产物ε-PL的抑制。     

氧载体对小白链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的影响

为了有效改善发酵体系中的溶氧水平,提高小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1发酵生产ε-聚赖氨酸的能力,文中通过对氧载体的种类、最佳添加浓度以及添加时间进行筛选,最终确定在0 h添加0.5%(V/V)的正十二烷促进ε-聚赖氨酸生产效果最佳。在5 L发酵罐0 h添加0.5%的正十二烷进行批次补料发酵,ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重分别可以达到(30.8±0.46)g/L和(33.8±0.29)g/L,较之对照组分别提高了31.6%和20.7%。ε-聚赖氨酸的产量和菌体干重的提高归因于0.5%正十二烷的添加促进发酵液中溶氧水平从23.8%提高到32%,同时发酵液中的一种主要副产物(聚二氨基丙酸)的含量下降31%。实验结果表明,正十二烷的添加可以提高S.albulus PD-1发酵液中的溶氧水平,抑制副产物的生成,促进ε-聚赖氨酸的合成。     

产ε-聚赖氨酸菌株生物合成条件研究

对一株产ε-聚赖氨酸Kitasatospora sp.PL6-3菌株进行生理生化特性研究。并通过5L发酵罐中ε-PL的合成条件的考察,发现在搅拌转速为350r／min,pH4.0,初糖浓度为3％并补糖的操作条件下ε-PL的质量浓度可高达6.65g/L,产率提高近10倍。     

等离子体作用结合氧限制模型选育利福霉素SV高产菌株

利福霉素SV毒性低、疗效高、抗菌谱广,主要由地中海拟无枝酸菌发酵生产,其发酵过程属于耗氧发酵,供氧直接影响产物形成。为减少发酵过程氧限制影响,进一步提高利福霉素发酵产量,通过构建定向氧限制模型,将常温常压等离子体诱变和无水亚硫酸钠氧限制筛选模型相结合,建立了利福霉素生产菌株24孔板快速培养的高通量筛选方法,高效选育出能够耐受低氧环境的利福霉素SV高产菌株NSMXG-M126,发酵代谢状态参数变化显示,该高产菌株具有更好的氧亲和力。同样的供氧条件下,与对照相比表现出较快的菌体生长速率和利福霉素SV的快速合成能力。在低供氧情况下发酵单位达到7839mg/L,较出发菌株提高48%,表明耐受低氧的突变菌株具有更高的利福霉素SV生产效率。     

基于pH调节和有机氮源流加调控补料分批发酵过程提高ε-聚赖氨酸产量

为了解决ε-聚赖氨酸(ε-PL)补料分批发酵过程中后期ε-PL产率下降的问题,提出了在补料阶段利用调节p H值和流加有机氮源(酵母粉)两种手段来提高ε-PL产率。利用上述两种策略,实现ε-PL平均产率分别达到4.62 g/(L·d)和5.16 g/(L·d),较未调控补料分批发酵(典型补料分批发酵)分别提高了27.3%和42.15%;同时,实现ε-PL产量分别达到36.95 g/L和41.32 g/L,较未调控补料分批发酵分别提高了27.4%和42.48%。进一步细胞活性染色和关键酶活性分析发现,两种策略均能显著提高细胞活力和关键酶活性。该研究结果表明,在发酵中后期通过调节p H值和流加酵母粉两种措施能够显著增强细胞活性和产生菌代谢能力,从而达到提高ε-PL产率和产量的目的。     

ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定

建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量的筛选方法。在分离培养基中加入150mg／L K2Cr2O7,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之问的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε-PL含量分析,确定4株ε-PL产生菌株。对其中一株ε-PL高产菌PL6-3菌株进行形态、生理生化和16S rDNA分析,结果表明PL6-3为北里孢菌属（Kitasatospora）。     

ε-聚赖氨酸生产菌株的筛选和鉴定*

建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量的筛选方法。在分离培养基中加入150mg/LK₂Cr₂O₇,以有利于放线菌的富集分离;并添加美蓝染料,利用产碱菌株碱性分泌物和美蓝之间的静电作用而形成独特的透明圈,从而灵敏地筛选得到产碱菌株;利用Dragendorff试剂与生物碱特有的颜色反应从产碱菌株中检出得到46株生物碱产生株;最后对产生物碱的菌株的发酵液进行ε-PL含量分析,确定4株ε-PL产生菌株。对其中一株ε-PL高产菌PL6-3菌株进行形态、     

ε-聚赖氨酸产生菌新菌株的筛选和产物结构鉴定

通过对Nishikawa的方法进行改进,在广东各地土样中筛选到一株产量为0.846 g/L的新ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌株,命名为Str-8。对Str-8菌株进行形态、生理生化和16S rDNA分析,初步确定为不吸水链霉菌Streptomyces ahygroscopic。纯化的发酵产物通过水解、质谱、紫外光谱等性质确定为ε-PL。