β2-糖蛋白Ⅰ 及其抗体复合物在APS发生发展及临床诊断治疗中的作用

抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome, APS）的临床特征为动静脉血栓形成或习惯性流产。血清学特征为抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody, aPL Ab）持续阳性等。目前,对APS治疗的主要方法为针对血小板的抗凝血治疗。然而,治疗过程中抗凝强度和持续时间难以把握,且对中风等重度患者疗效甚微。β2糖蛋白Ⅰ（β2 glycoprotein I, β2-GPI）是一种可与阴性磷脂结合的血浆糖蛋白,由5个结构域组成。第5结构域在与氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, oxLDL）等阴性磷脂结合后,改变自身构象并暴露位于第1结构域的抗原位点,随后被自身抗体特异性识别形成三元抗体复合物,激活血栓形成相关信号通路,促进APS的发生发展。因此,深入研究β2-GPI的分子结构及其在APS发生发展中的作用具有重要意义。本文对β2-GPI的结构,β2-GPI抗体复合物的形成过程,及其在APS发生发展和治疗诊断中的作用进行了阐述。最后,以β2-GPI为基础对APS的诊断和治疗方向进行了展望,旨在为β2-GPI作为APS精准治疗靶点药物的研发提供一定的参考。     

β2糖蛋白I及其抗体在抗磷脂抗体综合症病理进程中的作用探讨

抗磷脂抗体综合症(Antiphospholipid syndrome,APS)是以反复的动脉和静脉血栓形成为特征,与内皮细胞及单核淋巴细胞功能失调有关。β2糖蛋白Ⅰ是一种磷脂结合型糖蛋白,抗β2糖蛋白Ⅰ抗体与血栓形成密切相关,并且在APS的发生发展过程中具有决定性作用,但是抗β2糖蛋白Ⅰ及其抗体的功能尚未阐明。本文将围绕β2GPⅠ及其抗体的结构、生物学功能及其在血栓形成中的作用等方面进行详细的阐述,期望为APS发生发展过程中抗原抗体复合物调节细胞功能的分子机制提供新的视点。     

膜联蛋白Ⅰ的结构和功能

膜联蛋白Ⅰ(annexin Ⅰ)是annexins蛋白超家族中的一员,是结构相关钙离子依赖的磷脂结合蛋白.具有annexins超家族所共有的中心结构域和承担各自独特功能的N端结构域.通过调控细胞内磷脂囊泡的聚集、炎症反应和磷脂酶A2的活性而参与细胞信号传导、细胞分化和细胞凋亡等细胞重要的生命过程.     

磷脂对琥珀酸-细胞色素c还原酶的作用

琥珀酸细胞色素c还原酶除去90％以上的磷脂后活力丧失约95％。将去脂琥珀酸细胞色素c还原酶与磷脂和辅酶Q_2保温,可恢复其活性。活力恢复程度依赖于磷脂的组成。当磷脂酰胆碱(PC):心磷脂(CL):磷脂酰乙醇胺(PE)=2:2:1时活力恢复最高,比大豆磷脂的效果更为明显,单组分PC,PE或CL恢复活力较差。与酶蛋白紧密结合的CL和PC在活力可逆恢复中有重要作用。     

铜绿假单胞菌表面(氧化)低密度脂蛋白配体的研究

【背景】研究发现铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)与(氧化)低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL/oxidized low density lipoprotein,ox LDL)具有特异性相互作用,有报道证实P. aeruginosa表达的Rah U蛋白可以与LDL/ox LDL特异性结合。【目的】验证Rah U蛋白是否是P.aeruginosa表面主要的LDL/ox LDL配体。【方法】大肠杆菌表达Rah U蛋白(r Rah U),ELISA验证r Rah U与LDL/ox LDL的相互作用。利用同源重组的方法构建RahU基因缺失突变株(ΔRahU菌株)作为阴性对照菌株,制备小鼠抗r Rah U抗体,经WesternBlot及ELISA分别检测抗r Rah U抗体与P.aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白的结合。通过ELISA方法对P. aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/ox LDL的结合差异进行比较,并对不同蛋白酶水解ΔRahU菌体表面蛋白后ΔRahU菌株与LDL/ox LDL结合能力的差异进行比较。【结果】经ELISA验证rRahU与LDL/oxLDL存在特异性结合。Western Blot及ELISA方法证实小鼠抗rRahU抗体可以与P. aeruginosa野生型菌株膜蛋白中RahU蛋白及菌体表面RahU蛋白特异性结合,而不与ΔRahU菌株相互作用。P.aeruginosa野生型菌株及ΔRahU菌株与LDL/oxLDL结合能力无显著差异,且蛋白酶水解后ΔRahU菌株与LDL/oxLDL的结合能力相近。【结论】RahU蛋白是P. aeruginosa表面的LDL/oxLDL配体之一,但不是唯一的配体。     

人重组t-PA突变体与β2糖蛋白Ⅰ的相互作用

利用重组DNA技术和原核表达,得到了人体组织型纤溶酶原激活剂t-PA 的缺失型突变体r-PA和Kringle2功能区,并在变性条件下通过金属螯合层析纯化得到纯度较高的r-PA和Kringle2重组蛋白.用纤维蛋白活性平板检测到复性的r-PA和Kringle2都具有体外纤溶活性,并且β 2糖蛋白Ⅰ (β2-glycoprotein Ⅰ, β2GPⅠ)对r-PA的体外纤溶活性有显著的促进作用:在β2GPⅠ浓度为1 μmol/L和4 μmol/L时,r-PA的纤溶活性分别提高1.8和2.1倍.ELISA方法检测发现, β2GPⅠ与r-PA,Kringle2均有特异性结合,并且随着β2GPⅠ浓度的增加,它与包被在酶标板上的重组蛋白r-PA和Kringle2的结合都有趋于饱和的趋势,但其饱和浓度却均远高于β2GPⅠ与t-PA结合的饱和浓度.     

在肽库中筛选抗磷脂抗体的小肽抑制剂

β２糖蛋白Ⅰ（ｂｅｔａ－２－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ⅰ,β２ＧＰＩ）是一分子量为５０ ｋＤ的糖蛋白．从抗磷脂抗体综合症（Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｙｎｄｒｏｍ ,ＡＰＳ）患者身上获得的抗体可直接与β２ＧＰＩ作用．以β２ＧＰＩ为目标分子,在噬菌体十五肽库中筛选抗β２糖蛋白Ⅰ抗体的小肽抑制剂．通过四轮亲和性筛选,噬菌体的回收率从１．２６×１０－ ４％ 增加到３．１９×１０－ ２％ ．随机挑取噬菌体克隆测定其与β２ＧＰＩ的结合活性及其对β２ＧＰＩ与自身抗体结合的抑制活性,其中部分噬菌体克隆表现出４０％ 的抑制活性．经ＤＮＡ 序列测定,得到一组相关序列．该结果为研究β２ＧＰＩ的抗原表位奠定了良好的基础．     

血浆糖蛋白β2-GPI分子结构域与ox-LDL结合机制

通过酵母重组P.rβ_2-GPI-DV(β2糖蛋白I第5结构域)蛋白的荧光、圆二色谱及分子对接模拟,分析血浆糖蛋白β2-GPI-DV分子结构域与ox-LDL的结合机制。SDS-PAGE、Western blotting验证重组蛋白P.rβ_2-GPI-DV表达正确性及纯度;荧光、圆二色光谱、分子对接模拟解析重组蛋白与oxLDL、oxLDL配体oxLig-1可能存在的结合机制和位点。SDS-PAGE、Western blotting显示,在12 kDa大小处有目的蛋白存在且与特异性抗体结合;荧光、圆二色谱的发色基团、二级结构的变化趋势及分子对接模拟结果揭示,P.rβ_2-GPI-DV的Cys281-Lys-Asn-Lys-Glu-Lys-Lys287和Leu313-Ala-Phe-Trp316区域组成的活性口袋与oxLig-1的ω-COOH羧基是实现二者结合的关键。以上结果表明,β2-GPI通过其第5结构域(DV)的赖氨酸阳性区域与ox-LDL的ω-COOH基团识别结合,为血清中β2-GPI特异性结合ox-LDL的机制研究提供理论依据。     

一种新4/3型α-芋螺毒素突变体的合成及功能研究

目的：合成难溶的新4/3型α-芋螺毒素Eb1.3突变体Eb1.3［ΔR1,W13M］,并初步测定其与烟碱型乙酰胆碱受体亚型的结合作用。方法：采用Fmoc-固相法合成线性肽Eb1.3［ΔR1,W13M］,通过空气氧化折叠和磺化产物折叠获得含二硫键的折叠产物,利用两步折叠法测定其二硫键连接方式,双电极电压钳技术检测其药理活性。结果：Eb1.3［ΔR1,W13M］线性肽经折叠生成的主产物Ⅰ的二硫键排列方式为少见的C1-C4、C2-C3,而非典型的C1-C3、C2-C4,线性肽磺化后再经GSH交换可加速折叠,10 μmol/L的产物Ⅰ对乙酰胆碱受体α3β2亚型的抑制率为28.97%±8.44%。结论：新4/3型α-芋螺毒素Eb1.3突变体Eb1.3［ΔR1,W13M］形成非典型的二硫键C1-C4、C2-C3,产物Ⅰ对乙酰胆碱受体α3β2亚型具有一定的结合活性。     

腾冲嗜酸热两面菌伴侣素ATcpnβ底物结合特性研究

嗜酸嗜热古菌腾冲嗜酸热两面菌(Acidianus tengchongensis)来源的Ⅱ型伴侣素ATcpnβ已获得晶体结构解析,其顶端结构域突触下端相应于Ⅰ型伴侣素GroEL的重要底物结合位点处的氨基酸多为极性氨基酸,将其突变为疏水性氨基酸时,突变体对变性底物的捕获能力显著增强.表面等离子共振研究表明,ATcpnβ对于化学变性底物的再折叠中间体的其捕获作用不依赖于Mg2+/ATP.前期对该伴侣素冷冻电镜观察和结构解析表明,ATP的存在并不能驱动ATcpnβ从开放构型向闭合构型转变,但是表面等离子共振研究表明,ATcpnβ对热变性过程中已经聚集的底物的捕获作用依赖于Mg2+/ATP,说明Mg2+/ATP可以介导ATcpnβ顶端结构域一定的构象变化,引起顶端结构域疏水残基的进一步暴露,从而能够与大分子聚集体紧密结合.两个方面的研究均表明,伴侣素蛋白与变性底物的结合仍然以疏水相互作用为主,并且伴侣素蛋白与变性底物的结合受Mg2+/ATP的结合调控,与伴侣素蛋白疏水面的暴露程度相关.     

白色念珠菌磷脂酶活性与其毒力因子关系的研究

目的 探讨白色念珠菌磷脂酶活性与其毒力因子之间的关系以及与其遗传特征的相关性.方法 蛋黄平板法检测80株白色念珠菌磷脂酶活性,并测定磷脂酶高活性组、低活性组白色念珠菌的溶血活性、细胞表面疏水性、黏附上皮细胞能力及RAPD-PCR分析2组菌株的基因型特征.结果 磷脂酶阳性检出率为97.5%,2组PZ均值分别为0.639±0.043、0.847±0.079(P<0.05);2组的溶血活性、疏水率差异均无显著性(P>0.05),而磷脂酶高活性组菌株对上皮细胞的黏附力显著高于磷脂酶低活性组(P<0.05),磷脂酶活性与黏附力呈正相关(r=0.773,P<0.01).RAPD结果 表明磷脂酶活性与RAPD各电泳条带之间的回归系数不尽相同.结论 磷脂酶活性不能直接反应菌株其他毒力的情况,且RAPD分型也不能全面地反映磷脂酶这一单一的毒力特征,而是对菌株毒力特征的一个综合反映.     

内毒素致大鼠肺损伤时肺组织β受体的变化与膜磷脂代谢的关系

采用放射性配基结合分析法,现察内毒大致大鼠急性肺损伤时肺β－肾上腺素能受体（β－ＡＲ）的变化。分别用荧光偏振法和高效液相色谱测定肺组织细胞膜脂流动性和磷脂含量。结果显示：（１）静脉注射内毒素后４ｈ,大鼠肺β－ＡＲ的最大结合容量明显降低,较对照组减少４７％;（２）内毒素组肺膜脂流动性和磷脂含量均明显降低,同时伴有肺组织磷脂酶Ａ２（ＰＬＡ２）活性升高。提示：（１）β－ＡＲ下调导致其介导的功能减弱,在内毒素诱导的大鼠急性肺损伤发病机理中起一定作用;（２）ＰＬＡ２激活是膜磷脂减少的重要原因,后者可导致膜脂流动性降低,结果引起β－ＡＲ的侧向扩散和旋转运劝减弱,从而减少β－ＡＲ与配基结合的机率,出现β－ＡＫ下调。     

验证性筛选PDZ结构域结合配体文库快速研究HtrA2/Omi PDZ结构域的结合特性

HtrA2/Omi是一种线粒体丝氨酸蛋白酶, 在哺乳动物细胞中具有双重功能, 即诱导细胞凋亡和参与维持线粒体活性的动态平衡. PDZ结构域是最重要的蛋白质相互作用结构域之一, 参与多种生物学过程, 如细胞信号转导、蛋白质降解、细胞骨架组织等. 最近研究发现, HtrA2/Omi蛋白的PDZ结构域与配体的相互作用, 可以调节HtrA2/Omi蛋白自身的水解酶活性.以HtrA2/Omi PDZ结构域为研究对象, 用酵母双杂交系统验证性筛选PDZ结构域结合配体文库, 快速研究该结构域的结合特性, 并在人类全蛋白质组范围内预测并发现该结构域新的相互作用蛋白, 最后分析这些新的相互作用所能够形成的最小相互作用网络来评估其可信度. 研究结果揭示了HtrA2/Omi PDZ结构域新的结合特性, 即: 不仅能够结合已报道的II类PDZ配体而且还可以结合I类和III类PDZ配体, 并且配体-3位氨基酸具有一定范围内的可变性. 而且, 发现了7个新的HtrA2/Omi PDZ结构域相互作用蛋白, 为进一步阐明HtrA2/Omi蛋白的生物学功能提供了重要线索. 同时证明了验证性筛选目的结构域结合配体文库, 这一结构域结合特性研究新策略的实用性和高效性.     

乳腺癌转移中的磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱分析

我们以前曾报道花生四烯酸（arachidonic acid,AA)代谢产物可以促进乳腺癌细胞增殖和迁移。为了进一步寻找维持高转移乳腺癌细胞中AA高水平代谢的内源机制,深入探求AA代谢促进乳腺癌细胞转移的分子机理,我们应用HPLC/ESI/MSⁿ技术检测和分析了乳腺癌MCF-7和高转移乳腺癌LM-MCF-7细胞中溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholines,LysoPCs）和磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines,PCs）的成分和含量。我们发现了10种LysoPC的含量在LM-MCF-7细胞中显著高于MCF-7细胞,有6种PC可水解产生AA,它们在LM-MCF-7细胞中的含量显著低于MCF-7细胞,提示这些溶血磷脂含量的升高和磷脂含量的降低可能与乳腺癌转移相关。在LM-MCF-7细胞中,COX-2抑制剂吲哚美辛（indomethacin,Indo）和LOX抑制剂（nordihydroguaiaretic acid,NDGA）共同作用可明显下调cPLA2的活性,应用HPLC-ESI-MSⁿ技术比较cPLA2活性下调前后LM-MCF-7细胞中LysoPC和PC含量的变化,发现其中4种PC可被cPLA2水解产生AA。我们还发现,细胞内LysoPC与PC的比值可以反映cPLA2的活性。通过以上研究我们进一步证实了由cPLA2活性调节的AA释放及代谢对乳腺癌转移具有重要作用。     

活体内磷脂酰胆碱替代磷脂酰乙醇胺影响E.coli细胞的功能

【目的】通过磷脂酰胆碱(PC)阳性大肠杆菌菌株与磷脂酰乙醇胺(PE)阳性野生型和PE阴性突变型菌株比较,并用PC+PE+双阳性菌株佐证,从细菌形态、生理生化以及巨噬细胞对细菌的吞噬作用等方面探讨活体内磷脂酰胆碱能否替代磷脂酰乙醇胺。【方法】光学和电子显微镜观察细菌形态和结构;不同条件培养细菌并使用分光光度计测定OD600值,评估细菌的生长情况;使用SDS-PAGE和2-D电泳法测定细菌间质蛋白组分;用小鼠RAW264.7巨噬细胞系检测细菌的粘附和吞噬作用。【结果】与短棒状的PE+野生型细菌AD93/pDD72相比,PC+细菌AD93/ptac67中仍有25%丝状体;与PE-突变体AD93一样,PC+细菌AD93/ptac67仍需要添加二价离子Mg2+或Ca2+才能生长;与野生型AD93/pDD72相比,PC+细菌AD93/ptac67的周质蛋白组分、粘附率与相对吞噬效率呈现明显的差异;与野生型细菌Top10/ptac85相比,PE+PC+双阳性细菌Top10/ptac66的细胞壁外层、抗逆性和周质蛋白组分也显示差别。【结论】在活体内,膜磷脂中PC替代PE不能使PE-突变体细胞的功能完全恢复至野生型状态,PE和PC在功能上存在明显的差别,两者在功能上不能相互替代。     

千里光S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的结构域与功能位点分析（英文）

基于前期研究工作中构建的千里光全长c DNA文库,我们分离到千里光S-腺苷甲硫氨酸合成酶(Sadenosylmethionine synthase,SAMS)基因,本研究分析了该基因开放阅读框,并对该多肽3个高度保守序列形成的结构域和功能位点之间的关系进行了探讨。结果表明,该基因(Gen Bank ID:KC149908.1)编码的蛋白质由394个氨基酸残基组成,理论等电点5.48,相对分子质量43.40 k D;结构域比对和3-D模型分析结果表明,α-helix/β-strand是该蛋白结构域的主要组分,且SPOUT结构与甲基转移酶反应密切相关,其功能可能涉及核酸、蛋白质和磷脂的合成,本研究揭示SAMS的氨基酸保守基序是形成高级结构并决定其生物学功能之关键所在。     

重组人源SNX7蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及磷脂结合特异性分析

Sorting nexins(SNXs)是一类含有SNX-PX结构域,并在细胞内吞和内体分选运输过程中发挥重要调节作用的蛋白。SNX7是SNXs家族中的一员,含有PX结构域和BAR结构域,属于SNX-PX-BAR亚家族。斑马鱼实验表明,SNX7是在肝脏中大量表达的抗凋亡蛋白,并在胚胎肝脏的发育中发挥关键作用。为了从蛋白水平对SNX7进行研究,首先将编码人源PX-BARSNX7(SNX7的一个片段,包含PX和BAR结构域)的cDNA片段插入到原核表达载体p28a中,再将重组质粒转化到大肠杆菌Rosseta 2(DE3)中诱导表达,并用亲和层析、离子交换和分子筛层析对PX-BARSNX7进行了纯化。Western blotting结果表明,亲和层析、离子交换和分子筛层析纯化后获得了高纯度的PX-BARSNX7蛋白。动态光散射实验显示PX-BARSNX7蛋白均一性良好。磷脂结合实验表明,PX-BARSNX7具有较为广泛的磷脂酰肌醇结合能力,能够与PtdIns(5)P、PtdIns(4,5)P2和PtdIns(3,4,5)P3结合。     

核内转录因子IKAROS与血液肿瘤

IKAROS蛋白是一类含锌指结构域的核内转录因子,调节血液细胞分化发育。机体在血液细胞分化发育、天然免疫细胞的分化成熟、抗血液系统肿瘤发生等过程中均需要IKAROS蛋白的参与。IKAROS蛋白的功能依赖于其分子结构上的2个重要结构域:DNA结合结构域和家族蛋白相互作用结构域。DNA结合结构域与靶基因上游调控序列进行特异性结合,而蛋白相互作用结构域与家族蛋白分子结合形成二聚体,发挥IKAROS的生物学活性。IKAROS蛋白在细胞内代谢受到酪蛋白激酶2（casein kinase 2,CK2）和蛋白磷酸化酶1（protein phosphorylase 1,PP1）的调节,CK2将IKAROS蛋白磷酸化,使其失去生物活性|而PP1将磷酸化的IKAROS蛋白去磷酸化,从而增强IKAROS的生物活性。近几年临床研究发现,IKAROS蛋白的表达异常以及CK2激酶活性的增高与白血病的发生发展有密切关系。本文就IKAROS的分子结构特点、生物学功能、体内代谢调控方式及IKAROS在血液系统肿瘤发生发展过程中的生物学作用进行综述。     

突触结合蛋白Ⅰ的胞质片段与磷脂膜的相互作用

突触结合蛋白Ⅰ是神经细胞突触囊泡上的一个膜整合蛋白,C2AB是其具有重要功能的胞质片段.近年的研究表明,突触结合蛋白Ⅰ在钙引发的神经递质快速释放过程中起到钙感受器的作用,它与神经细胞突触前膜的相互作用与其生理功能有关,但是其作用机制还不清楚.利用气/液单层膜技术结合荧光发射光谱和圆二色光谱技术,发现C2AB倾向于插入带负电荷的磷脂膜中(如磷脂酰丝氨酸),而且插膜是钙依赖性的;对于不带电荷的磷脂不插膜.C2AB与膜之间的作用力主要为静电力.荧光发射光谱和圆二色光谱结果显示,它与膜相互作用时二级结构不发生显著变化.结果表明,突触结合蛋白Ⅰ钙依赖的插入负电荷膜特点,可以帮助解释其钙感受器的作用机制.     

热应激时大鼠肺组织中β-肾上腺素受体的变化与膜磷脂代谢的关系

本文观察了热应激对大鼠肺组织细胞膜中β-受体Bmax,磷脂酶A_2(PLA_2)活性,磷脂酰胆碱(PC),磷脂酰丝氨酸(PS)含量的影响及膜流动性的改变。测得正常大鼠肺中β-受体的B_(max),PLA_2活性,PC和PS值分别为479±94fmol/mg蛋白,78.5±8.2U,53.5±9.7mg/g湿重和425.1±68.1μg/g湿重;在热应激使肛温达42℃并持续15min时,β-受体B_(max)减少43％;PLA_2活性增加83％,PC和PS分别减少50％和47％;测流动性结果表明,热应激使红细胞和肺组织细胞膜流动性都明显减弱。作者认为这些变化之间的关系是:β-受体B_(max)的减少可能是热应激时激活了肺组织细胞膜中的PLA_2,加速了PC和PS等的分解代谢,使膜液晶态改变的结果。