栗疫病菌泛素结合酶基因(CpUBC)全长cDNA的电子克隆

电子克隆是一类近来发展起来的,通过有限的部分序列信息探针在Genbank数据库中比对,进而获得全长cDNA的真核基因克隆策略,而且该方法获得的全cDNAD克隆能为RT-PCR所验证.本研究首次应用电子克隆技术从粟疫病菌中克隆到一个1023个核苷酸长度的泛素结合酶基因(CpUBC)的全长cDNA.由NCBI提供的免费ORF Finder软件推导的该基因的开放阅读框(ORF)全长444个核苷酸,且起始密码子ATG及终止密码子TAG分别位于该泛素结合酶基因(CpUBC)cDNA的第245个核苷酸和第686个核苷酸.序列分析表明该基因(CpUBC)与稻瘟菌(Maganaporthe grises)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)及绿僵菌(Metarhizium anisopliae)在核苷酸水平的同源性分别为80.0%、73.2%和64.95;在氨基酸水平上的相似性分别为93.8%、72.2%和66.9%.     

第二代测序技术用于水稻和稻瘟菌互作早期转录组的分析

稻瘟菌为了实现对水稻的有效侵染,在侵染水稻时可能通过表达和转运一定数量的效应蛋白进入到水稻细胞,抑制和干扰水稻的先天免疫机制。文章利用Solexa第二代测序技术,通过开展水稻和稻瘟菌互作早期转录组的测定和分析,克隆和鉴定在互作早期表达的稻瘟菌效应蛋白基因。利用序列同源比对,我们从总计约12.5 M条序列标签中,分离和鉴定了338 942条来源于稻瘟菌的序列,并最终定位到779个稻瘟菌预测基因。其中108个基因很可能参与了水稻和稻瘟菌互作过程,42个基因为预测的分泌蛋白基因。通过RT-PCR分析,最终确认了42个预测分泌蛋白基因中有12个基因在侵染水稻早期有显著的表达,而其中有4个基因表现为侵染早期特异表达。文章尝试利用第二代测序技术实现稻瘟菌侵染早期特异表达基因,尤其是分泌蛋白基因的快速克隆和鉴定,为稻瘟菌效应蛋白基因的克隆和功能鉴定提供了较为有意义的探索。     

稻瘟菌无毒基因研究进展

无毒基因编码的产物激发病原物与植物特异性相互作用。水稻与稻瘟菌之间的特异互作符合“基因对基因”关系。从研究稻瘟菌无毒基因的意义、已鉴定和克隆的稻瘟菌无毒基因、稻瘟菌无毒基因与其抗病基因的互作特点等几个方面,对稻瘟菌无毒基因研究进展作了简要评述 。     

稻瘟菌无毒基因研究进展

稻瘟菌是引起水稻稻瘟病的病原物。水稻与稻瘟菌间存在广泛而特异的相互作用,是研究寄主与病原物互作的重要模式系统。本文对稻瘟菌与水稻互作最重要的激发子―无毒基因的研究现状进行了概括,讨论了无毒基因的定位、克隆方法以及已克隆无毒基因的功能及进化研究,同时对今后无毒基因研究的重要方向进行了探讨,为深入理解无毒基因的功能及与水稻可能的互作关系奠定了基础。     

稻瘟净（Blasticidin S）脱氨酶基因的克隆

从一株抗稻瘟净（ＢＳ）的Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ菌中克隆到一个ｂｌａｓｔｉｅｉｄｉｎＳ脱氨酶基因,命名为ｂｓｒＡＳ。ＤＮＡ序列分析表明ｂｓｒＡＳ不含内含子。编码区长３９０ｂｐ,编码１３０个氨基酸。将ｂｓｒＡＳ转化到稻瘟菌中,能使受体菌表达出ＢＳ脱氨酶的活性,从而产生抗药性。该基因可作为抗药标记基因使用,建立稻瘟菌的基因转化系统。     

甘蔗过氧化氢酶基因的电子克隆及生物信息学分析

应用电子克隆技术,获得甘蔗中一个过氧化氢酶基因的cDNA序列全长,命名为S-CAT。该基因全长2160bp,包含一个1479bp的开放阅读框,编码492个氨基酸。通过PSORT工具,预测甘蔗S-CAT蛋白存在于过氧化物酶体中。同源比对分析显示,S-CAT基因编码的氨基酸序列与水稻、玉米、高粱、朝鲜碱茅、葡萄等植物中过氧化氢酶基因所编码的氨基酸序列高度同源,同源性分别为97%,97%,95%,91%和92%。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

原核生物eno基因在系统进化中应用及水平转移分析

多基因系统发育研究方法是系统发育分析中的一个重要手段,基因树冲突已成为分子系统发育研究中日益突出的问题。烯醇化酶基因(eno)及其编码的蛋白广泛存在于五界系统中,烯醇化酶为糖酵解途径中重要酶类。文章选取原核生物已注释的eno基因序列进行了系统发育分析。对其中的138个模式菌株的eno基因序列进行系统发育分析和同源性搜索,发现19个模式菌株的eno基因是通过水平转移而来;并通过核苷酸组成、密码子偏好性和基因排列等基因特征分析,进一步验证了水平转移基因的外源性。结果表明:原核生物eno序列具有较高保守性,其大小适中,是研究原核生物系统发育的良好材料。文章在对基因水平转移的供体和受体菌株生活习性、进化历史以及烯醇化酶的结构和功能的研究过程中提供重要参考价值。     

稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因的表达

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭(Oryza sati-va L. cv.Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段.对这8个差示片段进行了回收、重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与甘露糖结合水稻凝集素和水稻盐诱导蛋白基因高度同源的差示片段为探针,筛选水稻非亲和性cDNA文库,获得12个阳性克隆.序列测定和数据库查询表明该基因的cDNA与水稻凝集素基因的cDNA及盐诱导蛋白基因的cDNA核苷酸同源性高达96%,推定的氨基酸序列与甘露糖结合水稻凝集素的氨基酸序列一致,与水稻盐诱导蛋白仅相差2个氨基酸.Southern杂交显示该基因在水稻基因组中有两个同源拷贝数,Northern杂交表明非亲和性稻瘟菌侵染可强烈诱导该基因表达.因此推测该基因参与了水稻对稻瘟菌侵染的防御反应.     

稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因的表达

利用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）,从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭（Oryza sati-vaL.cv.Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段,对这8个差示片段进行了回收,重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与甘露糖结合水稻凝集素和水稻盐诱导蛋白基因高度同源的差示片段为探针。筛选水稻非亲和性cDNA文库,获得12个阳性克隆。序列测定和数据库查询表明该基因的cDNA与水稻凝集素基因的cDNA及盐诱导蛋白基因的cDNA核苷酸同源笥高达96%。推定的氨基酸序列与甘露糖结合水稻凝集素的氨基酸序列一致。与水稻盐诱导蛋白仅相差2个氨基酸。Southern杂交显示该基因在水稻基因组中有两个同源拷贝数。Northern杂交表明非亲和性稻瘟菌侵染可强烈诱导该基因表达。因此推则该基因参与了水稻对稻瘟菌侵染的防御反应。     

亚心型扁藻叶绿体psbA基因的克隆及序列分析

psbA基因是叶绿体基因组中一个重要的光调控基因,编码光和系统Ⅱ反应中心的D1蛋白。根据叶绿体基因组序列高度保守的特性,利用菜茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii）psbA基因的保守序列（基因登录号：HQ667991．1）设计引物,采用PCR步移的方法从亚心型扁藻（Platymonassubcordiformis）基因组DNA中克隆到psbA基因全长（基因登录号：KF528742）。序列分析表明,亚心型扁藻psbA基因全长1939bp,编码区长度为1062bp,推导编码353个氨基酸,包括4个赖氨酸残基。有效密码子数显示脚删基因具有明显的密码子偏好性,并且偏好使用以A／T结尾的密码子。相对同义密码子使用度表明25个密码子在编码使用时具有偏好性,其中20个密码子以A／T碱基结尾,占到80％。其终止密码子使用了TAG。     

Characterization of a second gene involved in bacterio-opsin gene expression in a halophilic archaebacterium.

Southern blot analysis and nucleotide sequencing of DNA from three bacterio-opsin-deficient mutants of the archaebacterium Halobacterium halobium (M86, W105, and W109) revealed that they each contain an alteration in a region 2,000 to 3,800 base pairs (bp) upstream of the bacterio-opsin gene (bop). Nucleotide sequence analysis of this region, which is also located downstream of the previously characterized brp gene, revealed that it contains an open reading frame (ORF) of 2,022 bp. This 2,022-bp ORF has a start codon which overlaps the stop codon of the brp gene and is read in the same direction. The ORF could encode an acidic protein of 73,334 daltons (674 amino acids) with a predicted secondary structure typical of a soluble protein. Bop mutant M86 contains a 1,883-bp deletion extending from bp 351 of the ORF, to 197 bp beyond the stop codon. Mutant W105 has an ISH2 element integrated at bp 1239 of the ORF, and mutant W109 has an ISH26 element integrated at bp 1889. Our results suggest that the ORF is a gene (designated bat for bacterio-opsin activator gene) involved in bop gene expression.     

两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆及分析

为研究胰凝乳蛋白酶原在鱼类中的生理功能和作用机制,利用生物信息学的方法,成功获得了鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原的cDNA序列(ccCHTR1和ccCHTR2)并对其进行序列分析。结果显示,ccCHTR1 cDNA含有792 bp的开放阅读框,编码263个氨基酸;ccCHTR2 cDNA含有798 bp的开放阅读框,编码265个氨基酸。二者氨基端均含有18个氨基酸组成的信号肽,同时,在成熟肽的第15和16个氨基酸(R-I)之间存在一个切割位点。氨基酸比对结果显示,ccCHTR1和ccCHTR2具备胰凝乳蛋白酶原的保守结构特征,同时二者有72.8%的同源性,且都与斑马鱼有最高的同源性,分别是93.3%和73.5%。进化分析显示,二者分别与斑马鱼和鳕鱼亲缘关系最近,与哺乳动物的亲缘关系较远。     

水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNA的电子克隆

电子克隆是基因克隆的新策略,以小麦胞质葡萄糖－6－磷酸脱氢酶cDNA(Tagpdl克隆）序列为信息探针,在GenBank水稻nr数据库中找到高度同源的水稻基因组序列,通过人工序列拼接及RT-PCR确认得到了水稻该基因的全长cDNA序列,命名为OsG6PDH,OsG6PDH与小麦Tagpdl克隆的DNA一致率为88％,推导的氨基酸序列与小麦,番茄,烟草的胞质葡萄糖－6－磷酸脱氢酶基因的一致率分别为89％,79％,80％,经RT－PCR表达谱分析,OsG6PDH在水稻幼穗,胚,根,叶中都有表达,在幼穗与根中表达略高,另外,讨论了利用水稻基因组信息的电子克隆方法克隆水稻功能基因的可行性。     

牛Irak-1基因的电子克隆及生物信息学分析

电子克隆提供了一种利用基因组数据库克隆新基因全长cDNA序列的策略。利用小鼠Irak-1基因编码序列(NM_008363)为种子序列进行电子克隆获得了牛Irak-1基因完整编码序列。然后,用生物信息学方法分析了该基因的结构,微卫星位点,密码子偏性和氨基酸的同源性等。结果表明:该基因cDNA全长2 645bp,无内含子,最大开放阅读框2 157bp,编码718个氨基酸,与小鼠的同源性为77%。     

牛Pbx-1基因的电子克隆及生物信息学分析

新基因全长cDNA序列很难获得,但电子克隆却提供了基因克隆的一种策略.利用小鼠Pbx-1基因编码序列(NM_183355)为种子序列进行电子克隆获得牛Pbx-1基因完整编码序列.然后,用生物信息学方法分析了牛的Pbx-1基因的结构,密码子偏性和氨基酸的同源性等.结果表明:该基因cDNA全长1 754 bp,无内含子,最大开放阅读框1 305 bp.编码434个氨基酸.预测其编码的蛋白分子量为47 189.5 Da,与小鼠的同源性为81%.     

高粱抗坏血酸过氧化物酶基因的电子克隆及序列分析

利用高粱EST数据库及电子克隆等技术克隆了高粱APX基因,其开放阅读框大小为753bp,编码250个氨基酸残基,推导的蛋白质分子量为27.1kDa,等电点约为5.135.它与C4植物玉米的胞质APX(ACG41151)在进化上的距离最短,亲缘关系最近.高粱APX无信号肽,是亲水性蛋白,推测它定位于细胞质中.第33-44氨基酸片段为其过氧化物酶活性区域,第155-165氨基酸片段则是其与亚铁血红素配基结合的区域.预测的二级结构及三级结构都表明高粱APX含有较多的不规则卷曲和α螺旋,三级结构上呈椭球体.     

牛RHOQ基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术获得牛RHOQ基因cDNA序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析。结果表明,牛RHOQ基因的cDNA序列全长1 517 bp,包含1个618 bp开放阅读框,编码205个氨基酸;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于分泌系统囊泡;二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。牛RHOQ基因编码蛋白可能具有生长因子功能,可能在神经再生和突触延伸过程中起重要作用。     

家蚕MYST组蛋白乙酰转移酶基因Bm-mof的克隆表达和转录活性检测

MYST组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)广泛存在于从酵母到人的真核生物中,在真核生物的转录调控中起着重要的作用。利用NCBI已登录的其他物种该基因的氨基酸序列与家蚕的基因组框架图和表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库进行电子克隆,获得了家蚕中的同源基因。该基因长1 575 bp（GenBank登录号为DQ442997）,开放阅读框(ORF)长1 326 bp,无内含子。基因编码442个氨基酸,预测蛋白质的分子量为51.4 kD。序列中有HAT核心结构域、锌指结构域和染色质域3个保守的结构域,与其他物种同源基因具有较高的序列相似性。RT-PCR结果表明该基因在本实验所检测的家蚕各时期和组织中均有表达。将该基因用亚克隆的方法导入到pET50b载体中并成功地进行了原核表达,表达出了带有6个组氨酸和1个Nus·Tag标签的重组蛋白。