带内含子卡那霉素抗性基因双元载体构建及烟草转化

农杆菌介导法是植物基因转化的常用方法,然而由于筛选培养基中常用的抗生素头孢霉素和羧苄青霉素具有类植物激素活性,影响外植体的再生和转化频率。将一个植物的内含子插入卡那霉素抗性基因编码区的N端,合成了一个带内含子的卡那霉素抗性基因。构建带该基因的植物双元表达栽体pYP1202并转化烟草,受侵外植体在含卡那霉素50～200mg/L的选择培养基中抗性芽分化频率不受卡那霉素浓度影响,然而具有GUS活性的转化子占分化芽的比例却随着卡那霉素浓度的增加而升高。当培养基中加入500mg/L羧苄青霉素后受侵外植体产生的抗性芽频率比单一的卡那霉素筛选提高近1倍,高达91.4％,然而具GUS活性的转化子占抗性芽的比例仅有26.7％,在200m/L的卡那霉素筛选下,比例升至93.3％。用带内含子卡那霉素抗性基因构建的植物表达载体转化植物可以减少假抗性芽的产生。     

嗜热真菌 Thermomyces lanuginosus热稳定a—淀粉酶的纯化及特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus在液体培养基中于50℃静止培养14d,培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、SephacrylS-300分子筛层析和FPLC MonoQ离子交换层析,得到了凝胶电泳均一的淀粉酶。纯酶与淀粉反应不同时间后,用碘色反应法和DNS法测定淀粉和还原糖量,结果显示淀粉量在开始时迅速下降,但还原糖的量却增加很慢;产物经TLC层析分析为麦芽糖和少量葡萄糖。由此说明它为α-淀粉酶。用SDS-PAGE和Sephacryl S-300分子筛层析测定分子量为56000,不具亚基。酶反应最适温度和pH分别为65℃和4.5～5.0。在pH4.6条件下,酶在50℃是稳定的;60℃保温1h,仍保留94％的原酶活性;酶在70℃的半衰期为10min。钙离子对酶有激活作用。酶对糖原和糊精有一定的水解能力。     

泛肽交联酶(E2)通过苯丙氨酸解氨酶基因启动子参与水稻对紫外光的防护

迄今为止,诱导苯丙类化合物和黄酮类化合物合成并造成类黄酮的积累被认为是植物抵御紫外光的惟一主要的途径.苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙类化合物合成的关键酶.通过体内足印试验表明,在pal-1基因启动子中有一段序列CTCCAAC从CCCCTTC可以作为顺式元件参与紫外信号的传递.为了克隆与其相对应的反式因子,我们使用了酵母单杂交体系进行筛选.在鱼饵质粒中,我们将3个拷贝的顺式元件序列串联并与酵母异细胞血红素C(CYC)基本启动子连接.将鱼饵质粒和水稻cDNA表达质粒库共同转化到同一酵母中,通过筛选鉴定,克隆到一些编码泛肽交联酶(E2)基因.氨基酸同源性分析表明,该酶E2(RE2)与其他物种的泛肽交联酶具有很高的同源性.水稻泛肽交联酶受紫外光诱导加速合成.当RE2与水稻核蛋白进行交联反应后能与pal-1基因中顺式元件CTCCAACAACCCCTTC专一结合.从这些结果可以推测水稻泛肽交联酶RE2可能通过苯丙类化合物的合成代谢参与对紫外光的防护.     

泛肽交联酶（E2）通过苯丙氨酸解氨酶基因启动子参与水稻对紫外光的防护

迄今为止,诱导苯丙类化合物和黄酮类化合物合成并造成类黄酮的积累被认为是植物抵御紫外光的惟一主要的途径。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙类化合物合成的关键酶。通过体内足印试验表明,在pal-1基因启动子中有一段序列CTCCAACAACCCCCTTC可以作为顺式元件参与紫外信号的传递。为了克隆与其相对应的反式因子,我们使用了酵母单杂交体系进行筛选。在鱼饵质粒中,我们将3个拷贝的顺式元件序列串联并与酵母异细胞血红素C(CYC)基本启动子连接。将鱼饵质粒和水稻cDNA表达质粒库共同转化到同一酵母中,通过筛选鉴定,克隆到一些编码泛肽交联酶(E2)基因。氨基酸同源性分析表明,该酶E2(RE2)与其他物种的泛肽交联酶具有很高的同源性。水稻泛肽交联酶受紫外光诱导加速合成。当RE2与水稻核蛋白进行交联反应后能与pal-1基因中顺式元件CTCCAACAACCCCTTC专一结合。从这些结果可以推测水稻泛肽交联酶RE2可能通过苯丙类化合物的合成代谢参与对紫外光的防护。     

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A_(236)热稳定葡萄糖淀粉酶的纯化及其特性

嗜热真菌ThermomyceslanuginosusA_236在液体培养基中50℃下静止培养14天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl－Toyopearl疏水层析、SephacrylS100凝胶过滤和FPLCMonoQ离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经TLC分析为葡萄糖,证明纯化的酶为葡萄糖淀粉酶（EC3．2．1．3）。SDS－PAGE测定其分子量为72,000,不具亚基,PI为4．0,富含Val和Leu。酶反应最适温度和pH分别为70℃和5．0。在pH5．0条件下,酶在60℃保温1h,仍具有原酶活性。酶活性在70℃和80℃的半衰期分别为20min和6min。Ca2+对酶有激活作用,Fe3+、Al3+、Hg2+等金属离子对酶活力有一定的抑制作用。纯酶碳水化合物含量为12．4％。纯酶可水解可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糊精、糖原、麦芽三糖和麦芽糖,其中可溶性淀粉为最适底物。     

稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因的表达

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭(Oryza sati-va L. cv.Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段.对这8个差示片段进行了回收、重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与甘露糖结合水稻凝集素和水稻盐诱导蛋白基因高度同源的差示片段为探针,筛选水稻非亲和性cDNA文库,获得12个阳性克隆.序列测定和数据库查询表明该基因的cDNA与水稻凝集素基因的cDNA及盐诱导蛋白基因的cDNA核苷酸同源性高达96%,推定的氨基酸序列与甘露糖结合水稻凝集素的氨基酸序列一致,与水稻盐诱导蛋白仅相差2个氨基酸.Southern杂交显示该基因在水稻基因组中有两个同源拷贝数,Northern杂交表明非亲和性稻瘟菌侵染可强烈诱导该基因表达.因此推测该基因参与了水稻对稻瘟菌侵染的防御反应.     

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A236热稳足葡萄糖淀粉酶的纯化及其特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus A2a6在液体培养基中50℃下静止培养14天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、Sephacryl S100凝胶过滤和FPLC Mono Q离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经TLC分析为葡萄糖,证明纯化的酶为葡萄糖淀粉酶(EC 3．2．1.3)。SDS-PAGE测定其分子量为72,000,不具亚基,pI为4．0,富含val和Leu。酶反应最适温度和pH分别为70℃和5．0。在pH5．0条件下,酶在60℃保温lh,仍具有原酶活性。酶活性在70℃和80℃的半衰期分别为20min和6min, Ca²⁺对酶有激活作用,Fe³⁺、Al³⁺、Hg²⁺等金属离子对酶活力有一定的抑制作用。纯酶碳水化合物含量为12．4％。纯酶可水解可溶性淀粉,直链淀粉、支链淀粉．糊精、糖原、麦芽三糖和麦芽糖,其中可溶性淀粉为最适底物。     

嗜热真菌 Thermomyces lanuginosus热稳定a—淀粉酶的纯化及特性

嗜热真菌Thermomyces lanuginosus在液体培养基中于50℃静止培养14d,培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析、SephacrylS-300分子筛层析和FPLC MonoQ离子交换层析,得到了凝胶电泳均一的淀粉酶。纯酶与淀粉反应不同时间后,用碘色反应法和DNS法测定淀粉和还原糖量,结果显示淀粉量在开始时迅速下降,但还原糖的量却增加很慢;产物经TLC层析分析为麦芽糖和少量葡萄糖。由此说明它为α-淀粉酶。用SDS-PAGE和Sephacryl S-300分子筛层析测定分子量为56000,不具亚基。酶反应最适温度和pH分别为65℃和4.5～5.0。在pH4.6条件下,酶在50℃是稳定的;60℃保温1h,仍保留94％的原酶活性;酶在70℃的半衰期为10min。钙离子对酶有激活作用。酶对糖原和糊精有一定的水解能力。     

农杆菌-植物间基因转移的分子基础

植物病原细菌多以Ⅲ型分泌系统运送毒性因子或无毒基因产物到植物细胞,但根癌农杆菌利用Ⅳ型分泌系统转移致瘤基因片断T-DNA到植物细胞核,并整合到植物基因组,使植物产生肿瘤,作者将介绍vir基因的诱导、T-DNA的加工、T-DNA的转移,以及T-复合体运输的装备等方面的最新研究进展,以探讨农杆菌-植物间基因转移的分子基础,研究该系统转移基因的分子基础将有利于开发和改良植物遗传工程的载体工具;另外,农杆菌-植物作为一种模式植物病害系统,其研究也为植物-病原菌的基础理论研究提供参考。由于有些人体病原细菌也采用Ⅳ型分泌系统运送毒性因子到人体细胞,研究农杆菌-植物间的基因转移系统也有利于医学研究。