一种来源于克劳氏芽孢杆菌的高碱性尿酸氧化酶的异源表达及重组酶性质分析

以碱性蛋白酶生产菌克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)基因组DNA为模板PCR扩增获得尿酸氧化酶基因(BcU),插入原核表达载体pET28α中,构建表达载体pET-BcU,并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-BcU。经IPTG诱导,重组菌BL21(DE3)/pET-BcU表达出有活性的尿酸氧化酶,含空质粒的重组菌在同样条件下没有酶活。酶学性质分析显示,重组酶最适pH值为9.0,在pH值9.0～11范围内酶活几乎不变,是一种高碱性尿酸氧化酶。     

菠菜乙醇酸氧化酶基因的克隆及表达

采用RT-PCR技术从菠菜总RNA中分离扩增了乙醇酸氧化酶（GO）基因的cDNA序列,首先克隆到质粒pMD18T,进行了测序。然后将乙醇酸氧化酶的cDNA分别亚克隆至质粒pThioHisC、 pTIGTrx、pBV220和pET-2b(+),分别转化大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）,并对重组乙醇酸氧化酶在大肠杆菌中的表达进行了研究。SDSPAGE和酶活分析表明,菠菜乙醇酸氧化酶在E.coli BL21 (DE3) （pTIGTrxGO）和E.coli BL21(DE3) （pET-22b(+)GO）里得到了高水平的表达,其中E.coli BL21(DE3) （pET-22b(+)GO）的乙醇酸氧化酶活性较高。     

尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

尿酸氧化酶(urate oxidase,Uricase,EC.1.7.3.3)是一种能将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。合成黄曲霉(Aspergillus flavus)尿酸氧化酶基因,构建表达载体pET43.1a/uox,重组质粒经双酶切鉴定和序列分析,证明插入序列正确,转化到大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,菌株经诱导表达尿酸氧化酶蛋白,目的蛋白经过超声破碎,经检测以可溶性蛋白为主;菌体经超声破碎后,上清经过阴离子柱和阳离子柱两步纯化,得到尿酸氧化酶纯品,纯品以分光光度法进行体外酶活性测定。结果显示:尿酸氧化酶在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白的50%;表达产物经过两步层析柱纯化,获得电泳扫描纯度为95%的纯品;在体外活性测定中具有分解尿酸的能力,在临床检测和治疗中有重要意义。     

链霉菌来源的UDP_葡萄糖_4_差向异构酶基因的克隆表达及酶性质研究

经同源性比较,链霉菌139（Streptomyces sp.139）产生胞外多糖依博素的生物合成基因簇中ste19 基因编码的蛋白Ste19与UDP_葡萄糖_4_差向异构酶有较高同源性。将ste19 基因克隆至质粒pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。产生的可溶性Ste19重组蛋白,占细胞总蛋白的26%,说明该基因高GC含量（73.8%）及第三位碱基偏向使用GC(96.2%)并未影响其高效表达。SDS_PAGE结果显示重组蛋白的分子量约37kD,与理论推测值基本相同。经亲和层析纯化后得到了较高纯度的重组蛋白,经HPLC分析纯度为92.9%。酶活性分析表明：Ste19蛋白可将UDP_葡萄糖转化为UDP_半乳糖,因此,Ste19蛋白是UDP_葡萄糖_4_差向异构酶,它可能参与了依博素的生物合成。     

黄曲酶尿酸氧化酶突变体的构建、表达、纯化及生物学活性分析

采用融合PCR的方法将黄曲霉尿酸氧化酶(UOX) 基因的307~309 bp的TGC(Cys) 突变为GCC(Ala),将所获得的突变体基因克隆到原核表达质粒pET-42a(+) 后转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导,突变体蛋白 (UOX-Ala103) 得到高水平的可溶性表达,目的蛋白占总蛋白含量的45％。疏水柱及阴离子柱纯化后,UOX-Ala103蛋白纯度＞98％。Western blotting分析证实UOX-Ala103能与抗UOX单抗特异结合。与天然型相比较,其体外生物学活性增加约60％,在高尿酸血症小鼠模型体内也有良好的降解尿酸的活性。     

Δ12-脂肪酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达*

把高山被孢霉 (Mortierellaalpina)和深黄被孢霉 (Mortierellaisabellina)的Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET21a中 ,获得重组表达载体pMACL12和pMI CL12 ,并用氯化钙方法将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中。筛选阳性克隆进行培养 ,然后分离其细胞膜蛋白 ,并构建体外表达体系 ,同时加入外源性底物油酸进行表达。经气相色谱 (GC)分析表明 ,分别有 17.87%和 17     

斑马鱼尿酸氧化酶基因的克隆与原核表达

目的探讨斑马鱼尿酸氧化酶基因的克隆与原核表达的方法,研究重组斑马鱼尿酸氧化酶(ZUO)的理化性质与生物学功能。方法用PCR的方法克隆斑马鱼尿酸氧化酶基因,用pET28a质粒进行原核表达。结果成功克隆了斑马鱼尿酸氧化酶基因并完成了测序鉴定,该基因在大肠杆菌表达系统中得到有效表达且具有体外氧化尿酸的生物学功能。目的蛋白为胞内可溶性蛋白,占可溶蛋白总量的50%左右。最佳诱导条件为27℃16 h,粗酶最佳溶解pH为9.16,在此缓冲液溶解条件下,粗酶比活性为1.94 U/mg。获得的重组ZUO产量达64.8 U/g湿菌,高于直接从动物肝脏组织萃取的尿酸氧化酶。结论斑马鱼尿酸酶基因能在大肠杆菌表达系统中表达,其溶解pH比基因工程表达的重组猪尿酸氧化酶略低,对后续开发痛风治疗新药有利。     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明,zot基因编码399个氨基酸,其中4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET28(a+)构建表达质粒pET-ZOT,转化大肠杆菌BL21(DE3)筛选表达菌株BLZOT。表达菌株经1mmol/L IPTG诱导表达3～5h后,表达大量ZOT蛋白,并形成包涵体。经SDS-PAGE分析重组ZOT蛋白分子量约为47kD,凝胶自动扫描分析表明,重组ZOT约占菌体可溶性蛋白量的15%以上。本工作为进一步研究蛋白多肽类药物的口服奠定了良好的基础。     

猪尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

本研究报道了猪尿酸氧化酶(Porcine urate oxidase,pUOX)的原核表达载体的构建、pUOX的蛋白表达条件的优化以及对pUOX经纯化后进行活性检测和酶学性质分析。利用RT-PCR从猪肝总RNA中克隆pUOX,定向插入原核表达载体pET30a(+)中,构建表达载体pET30a(+)/pUOX,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中。重组质粒pET30a(+)/pUOX经双酶切鉴定和序列分析,证实已成功构建了重组表达载体。重组表达菌经IPTG诱导表达了约为41kD的蛋白,与预期分子量一致,并对pUOX蛋白表达条件进行了优化,表达的蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中,包涵体经过变性、复性后,用Ni2+-NTA对复性蛋白进行亲和纯化,并对纯化蛋白进行了活性检测和酶学性质分析,纯化的重组pUOX的比活为50.63IU/mg,并发现重组蛋白在最佳温度、热稳定性等方面与天然pUOX相同,为后续动物实验奠定重要的基础。     

耐辐射奇球菌recA基因的克隆、表达及其对recA缺损大肠杆菌辐射抗性的影响

将耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）的recA基因克隆到表达质粒pET15b中,并在Escherichia coli HMS(DE3)中高效表达了可溶性的RecA重组蛋白。同时将recA基因通过穿梭质粒pRADZ3导入recA缺损E. coli TG2细胞中,Western印迹实验显示RecA蛋白能够在不需要诱导剂IPTG的条件下稳定表达。辐射抗性实验表明,D. radiodurans的recA基因在E. coli细胞中的表达能够完全补偿recA缺损E. coli辐射抗性能力。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

乳糖诱导重组尿酸酶基因在大肠杆菌中的表达

对用乳糖替代异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组产朊假丝酵母尿酸酶基因在E.coli JM109(DE3)中表达进行了研究,拟建立一种高效低成本的生产重组尿酸酶的工艺路线。通过摇瓶试验对诱导所采用的乳糖浓度,诱导时机和诱导持续时间进行了优化,并考察在乳糖诱导下的目的产物表达动力学,随后在5 L发酵罐上进行扩大化培养以验证摇瓶优化的结果,进一步将乳糖作为诱导剂应用于高密度发酵过程。实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度为5 g/L,最佳诱导时机是对数生长期中后期,诱导持续时间为9~10h;按照优化的条件在摇瓶和5 L发酵罐上进行分批培养,重组尿酸酶最大表达量可达菌体总蛋白的26%左右,可溶性蛋白的36%左右,略高于IPTG的诱导效果;高密度发酵过程菌体终密度达到OD600值40以上,尿酸酶表达量占菌体总蛋白25%左右。     

OKP-B-13型β-内酰胺酶的克隆与表达

目的构建OKP-B-13型β-内酰胺酶的表达载体。方法抽提菌株的质粒,应用PCR扩增OKP-B-13基因全长编码序列,扩增产物经Nde I、Xho I酶切后连接至pET-26b(+)表达载体,重组质粒经酶切及DNA测序确证后,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。超声破碎法提取表达蛋白产物,检测其活性,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点(pI)。结果PCR扩增获得879 bp的产物,重组表达载体经Nde I、Xho I酶切及DNA测序后表明,目的基因已成功接入表达载体,重组菌的粗提物经头孢硝噻吩检测显示具有β-内酰胺酶活性,显示载体[pET-26b(+)/OKP-B-13]构建成功。目的等电点为7.1。结论β-内酰胺酶OKP-B-13在原核表达细胞中实验了基因重组表达,为进一步分析酶的特性提供条件。     

人胶源神经营养因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

胶源神经营养因子（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是大鼠B49细胞系中分离纯化得到的一种蛋白质^[1],由于其对多巴胺神经元的专一性的神经营养作用而被发现。GDNF成熟蛋白由134个氨基酸组成,具有两个N-糖基化位点。它属于TGF-β基因家族但与该家族其它成员的氨基酸序列同源性仅为20%,可能是一个新的亚家族。最近研究表明,它对发育中的运动神经元也有很强的神经营养作用^[1]。对啮齿类^[3,4],灵长类的弥猴^[5]的活体试验表明,胶源神经营养因子是一种治疗神经退化发夹知病如帕金森氏症、肌萎缩性脊髓索硬化症等的非常有效的潜在药物。由于GDNF在体内含量极低而且公在发育早期表达,因而只有通过基因工程方法才能获得大量的GDNF。本文报道采用PCR方法从中国入基因组DNA 中扩增出编码GDNF的基因,并实现在大肠杆菌中的高效表达。这为进一步研究GDNF的结构和生物学功能打下了坚实的基础。     

链霉菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的克隆表达及酶性质研究

经同源性比较,链霉菌139(Streptomycessp.139)产生胞外多糖依博素的生物合成基因簇中ste19基因编码的蛋白Ste19与UDP_葡萄糖_4_差向异构酶有较高同源性。将ste19基因克隆至质粒pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。产生的可溶性Ste19重组蛋白,占细胞总蛋白的26%,说明该基因高GC含量(73.8%)及第三位碱基偏向使用GC(96.2%)并未影响其高效表达。SDS_PAGE结果显示重组蛋白的分子量约37kD,与理论推测值基本相同。经亲和层析纯化后得到了较高纯度的重组蛋白,经HPLC分析纯度为92.9%。酶活性分析表明:Ste19蛋白可将UDP_葡萄糖转化为UDP_半乳糖,因此,Ste19蛋白是UDP_葡萄糖_4_差向异构酶,它可能参与了依博素的生物合成。     

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

胆固醇氧化酶基因的克隆及在E.coli中的表达

根据NCBI中报道的BrevibacteriumsterolicumATCC21387胆固醇氧化酶基因序列,采用PCR方法以Brevibacteriumsp.DGCDC-82的基因组为模板,扩增得到了编码胆固醇氧化酶的基因,该基因与来源于BrevibacteriumsterolicumATCC21387的胆固醇氧化酶基因(choB)同源性为98%。将得到的基因定向克隆到pET28a载体中,转化至含有编码argU和proL基因的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP中表达。经过IPTG诱导后,经SDS-PAGE检测在约55kD处有一蛋白表达条带,目的蛋白表达量约占总蛋白的16%,经测定酶活为340U/L。