双歧杆菌完整肽聚糖对脐血来源树突状细胞分化成熟的影响

目的研究两歧双歧杆菌完整肽聚糖（WPG）对脐血来源树突状细胞（DC）形态及分泌细胞因子的影响,了解双歧杆菌WPG对DC分化、成熟及免疫调节功能的作用;并为益生菌及其生物活性成分的进一步开发提供依据。方法分离正常孕妇脐血单个核细胞诱导生成未成熟树突状细胞（Dendritic cells,DCs）,实验组在培养的第7天分别加入两歧双歧杆菌WPG（5μg／ml）、两歧双歧杆菌全菌（100μg/ml）,阳性对照组加入脂多糖（LPS）,阴性对照组仅加入培养基。倒置显微镜在培养各期形态学观察,流式细胞术检测表面标志物CD83及CD1a的表达,NLR检测DCs刺激同种异体T淋巴细胞能力,ELISA法测定DCs培养上清中IL-12p70、IL-10的分泌。结果脐血单核细胞在双歧杆菌WPG与GM-CSF、IL-4协同诱导作用下,能成为形态上具有典型树突状突起的DCs;诱导后的CB-MDDCs刺激同种异体T细胞的增殖能力及分泌IL-12：p70、IL-10的水平显著高于阴性对照组（P〈0．01）且细胞表面标志物CD83及CD1a的表达增加。结论（1）双歧杆菌WPG能影响CB-MDDCs的成熟状态。（2）双歧杆菌WPG对CB-MDDCs成熟程度及分泌细胞因子水平的影响强于双歧杆菌全菌,说明WPG是双歧杆菌主要免疫活性成分。     

双歧杆菌完整肽聚糖对小鼠骨髓来源树突状细胞分泌IL-12的影响

目的探讨相同剂量双歧杆菌完整肽聚糖（WPG）在不同时间对小鼠骨髓来源树突状细胞分泌IL-12的影响。方法将双歧杆菌WPG与小鼠骨髓来源树突状细胞共培养,分别在加入WPG后0、12、24、36、48和60h收集培养上清液,用ELISA法测定不同时间点上清液中IL-12的量。结果双歧杆菌WPG与树突状细胞共培养后,上清液中IL-12的量在24h内逐渐升高,至24h达高峰,24h后呈下降趋势;同0h组比较,12、24和36h组IL-12分泌量明显增加（P〈0.05）,而48、60h组同0h组比较差异无显著性（P〉0.05）。结论双歧杆菌WPG能够刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞分泌IL-12;双歧杆菌WPG对树突状细胞的免疫刺激存在时间效应关系。     

双歧杆菌WPG对正常和哮喘模型小鼠骨髓来源树突状细胞分泌细胞因子的影响

目的研究双歧杆菌完整肽聚糖(WPG)对正常和哮喘模型小鼠骨髓来源树突状细胞(DC)分泌细胞因子的影响,探讨双歧杆菌WPG在防治过敏性疾病中的免疫调节作用。方法分离正常及哮喘模型小鼠骨髓单个核细胞,诱导生成未成熟DC,在培养的第7天将细胞分为WPG组、阳性组,其中WPG组每毫升培养液中加入双歧杆菌WPG 5μg,阳性组每毫升培养液中加入脂多糖(LPS)1μg,ELISA法检测DC培养上清中IL-12及IL-10的水平。结果正常小鼠WPG组DC分泌的IL-12、IL-10的量低于阳性组,哮喘小鼠WPG组DC分泌IL-12、IL-10的量高于阳性组,差异均具有统计学意义(P0.05);哮喘小鼠WPG组、阳性组DC分泌IL-12、IL-10的量分别低于正常小鼠WPG组、阳性组,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论双歧杆菌WPG对具有功能缺陷的哮喘小鼠DC功能有一定调节作用,但其调节作用有一定限度,不能使细胞功能完全恢复到正常时的水平。     

双歧杆菌对肠上皮细胞生长和白介素-8分泌功能的影响

目的探讨双歧杆菌对人肠上皮细胞株HT29生长及其IL-8分泌水平的影响。方法HT29细胞在96孔板上生长24h后分为正常细胞对照组、高剂量双歧杆菌共培养组（细菌终浓度为1×10^10CFU／m1）、低剂量双歧杆菌共培养组（细菌终浓度为1×10^6CFU／ml）、轮状病毒感染对照组,分别加入不同剂量双歧杆菌和感染轮状病毒共培养,继续培养24h,光镜下观察细胞生长状态,MTT比色法检测细胞活性情况,ELISA检测细胞培养上清中IL-8表达水平。结果光镜下观察到双歧杆菌与HT29细胞共培养后细胞形态无明显改变,共培养24h后MTT检测双歧杆菌对HT29细胞增殖和调亡无明显影响,但轮状病毒感染对照组细胞病变脱落,活细胞数量明显减少。共培养6h,其余3组细胞培养上清中IL-8分泌较正常细胞对照组增加（P〈0．05）,高剂量双歧杆菌组增加较低剂量双歧杆菌组差异有显著性（P〈0．05）,但两个剂量组均明显低于轮状病毒感染阳性对照组的IL-8分泌增加水平（P〈0．05）;感染后24h,细胞培养上清中IL-8分泌水平高于正常细胞对照组（P〈0．05）,但高、低剂量双歧杆菌组之间差异无显著性（P〉0．05）,两个剂量组IL-8分泌增加水平均明显低于轮状病毒感染阳性对照组（P〈0．01）。结论两歧双歧杆菌共培养不影响HT29细胞的生长,双歧杆菌能够促进HT29细胞分泌细胞因子IL-8,但明显低于致病微生物刺激引起的细胞因子分泌水平改变,这种促进作用无时间-剂量依赖关系,提示双歧杆菌与肠道内致病微生物对肠道免疫功能的影响不同,双歧杆菌促进肠上皮细胞分泌IL-8可能与其参与的肠道黏膜免疫系统发育成熟相关。     

从细胞因子的分泌探讨过敏孕妇脐血来源树突状细胞的功能特点

目的通过分析过敏孕妇脐血单核细胞来源树突状细胞（Dendritic cells,DCs）分泌细胞因子水平与正常孕妇来源DCs的差异,了解过敏来源树突状细胞功能的特点,为过敏性疾病的细胞学研究奠定基础,并为防治过敏性疾病寻找最佳时期。方法分离过敏及正常孕妇脐血内单核细胞,在GM-CSF及IL-4的作用下诱导生成未成熟DCs,在培养的第7天加入LPS（1μg/ml）诱导细胞成熟,阴性对照组仅加入细胞因子及培养基。于培养第9天收集培养上清,用ELISA法检测培养上清中IL-12p70及IL-10的分泌水平。结果过敏孕妇来源树突状细胞分泌细胞因子IL-12p70及IL-10的能力明显低于正常孕妇组。结论过敏孕妇来源树突状细胞可能存在功能上的缺陷,这可能是导致有过敏家庭史婴儿易患过敏性疾病的细胞学基础,孕期可能为防治过敏性疾病发生的最佳时期。     

双歧杆菌对过敏性哮喘儿童树突状细胞分泌IL-10、IL-12等细胞因子的影响

目的探讨双歧杆菌对过敏性哮喘儿童外周血单核细胞（PBMC）来源的树突状细胞（DC）分泌IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和IFN-γ的影响。方法从15例过敏性哮喘儿童和15例非哮喘儿童的外周血单个核细胞诱导生成未成熟DC,加入双歧杆菌后继续培养DC2d,用ELISA方法检测培养上清中IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和IFN-γ的水平。结果双歧杆菌能明显刺激哮喘儿童DC分泌IL-12、IFN-γ,IL-1β及IL-6和非哮喘儿童DC分泌IL-12、IL-10、IL-1β及IL-23水平增高。结论双歧杆菌能够刺激过敏性哮喘儿童DC分泌IL-12和IFN-γ,可能改变Th2优势分化,纠正Th1／Th2失衡。同时双歧杆菌还能刺激哮喘儿童DC分泌IL-1p及IL-6增高,达到促进,Th17细胞分化的作用。     

五种益生菌菌株对脐血单个核细胞免疫作用的实验研究

目的比较不同剂量的5种不同益生菌菌株的免疫调节作用,为选择适当的菌株进行治疗提供依据。方法取7例健康孕妇的脐血分离出的脐血单个核细胞(cord blood monocular cells,CBMC),分别与长双歧杆菌6-1株、婴儿双歧杆菌CGMCC313-1株、嗜酸乳杆菌YIT2004株、粪链球菌YIT0072株和酪酸梭状芽胞杆菌CGMCC313-2株,以菌和CBMC比例2∶1(低)、20∶1(中)和200∶1(高)共培养24~36 h,同时设阴性对照(PBS)和阳性对照(脂多糖,LPS)。然后采用流式细胞仪检测各组CBMC表面CD4、CD25分子表达情况,用ELISA方法检测培养上清中IL-10、IL-12、IL-4、TGF-β1和IFN-γ的水平。结果 (1)与阴性对照(PBS)组相比,除200∶1比例的酪酸梭状芽胞杆菌CGMCC313-2株能够显著提高CBMC表达CD4CD25(10.45±3.16 vs 5.84±2.32,P=0.009)以外,其余益生菌菌株对表达CD4CD25差异均无统计学意义(P0.05)。(2)长双歧杆菌6-1株在中高剂量下,能够刺激CBMC产生IL-10和IFN-γ,对产生IL-12无明显影响。(3)婴儿型双歧杆菌CGMCC313-1株在各个剂量下均能够刺激CBMC产生IL-10,对IL-12和IFN-γ产生无明显影响。(4)酪酸梭状芽胞杆菌CGMCC313-2株在中高剂量下,能够刺激CBMC产生IL-10,对IL-12和IFN-γ产生无明显影响。(5)粪链球菌YIT0072株在低中剂量下,能够刺激CBMC产生IL-10、IL-12和IFN-γ,而高剂量则无影响。(6)嗜酸乳杆菌YIT2004株在中高剂量下,能够刺激CBMC产生IL-10,在中剂量下,能够刺激CBMC产生IFN-γ,对IL-12无影响。(7)在本研究中均未能检测出IL-4和TGF-β1。结论在目前国内使用的益生菌菌株中,仅酪酸梭状芽胞杆菌CGMCC313-2株能够显著提高CBMC表达CD4CD25。5种菌株均能够刺激CBMC产生抗炎症因子IL-10;长双歧杆菌6-1株、粪链球菌YIT0072株和嗜酸乳杆菌YIT2004株能够刺激CBMC产生Th1型细胞因子INF-γ,仅粪链球菌YIT0072株能够刺激CBMC产生IL-12。各个菌株在不同的剂量下,具有不同作用。提示在应用益生菌治疗免疫等相关性疾病时,应该考虑不同菌株对免疫细胞的不同作用机制。     

稀土元素对两歧双歧杆菌生长的影响

目的：报道不同浓度稀土元素铈和镧（1－1000ug/ml)对两歧双歧杆菌生长的影响。方法：试管培养与连续厌氧培养法,结果：当两种稀土元素浓度大于300ug/ml时,双歧杆菌的生长明显受到抑制,当稀土元素浓度在100－200ug/ml时,对双歧杆菌生长有轻微抑制,低浓度的稀土元素对双歧杆菌无刺激生长作用,稀土元素（100ug/ml)对厌氧连续培养的双歧杆菌同样有明显的抑制作用,随着稀土元素被洗脱,细胞的生长才逐渐缓慢恢复,试管培养中加入一定浓度稀土元素（100ug/ml),连续取样检查,也可观察到稀土元素对双歧杆菌的抑制情况,结论：一定浓度稀土元素铈和镧对双歧杆菌生长有促进作用。     

双歧杆菌完整肽聚糖对食物过敏小鼠调节性T细胞影响的研究

目的以食物过敏小鼠为动物模型,通过灌喂双歧杆菌完整肽聚糖(Whole Peptidoglycan,WPG),观察其对调节性T细胞的作用。方法 4～6周龄SPF级无鸡蛋喂养BALB/c雌鼠随机分为3组,每组8只。取其中2组建立食物过敏模型,分别为OVA致敏阳性对照组、OVA激发后灌喂双歧杆菌WPG治疗组和生理盐水对照组。采用ELISA法检测各组血清中OVA特异性IgE、IL-10和TGF-β1水平;流式细胞术分析脾脏单个核细胞悬液中CD4+CD25+调节性T细胞的数量变化。结果 OVA组IL-10、TGF-β1水平显著高于对照组(P分别0.05和0.01);WPG组血清IL-10和TGF-β1水平显著低于OVA组(P0.05)。OVA组脾CD4+CD25+T淋巴细胞的百分比低于对照组(P0.05),WPG组与OVA组相比有升高趋势,差异有统计学意义(P0.05);OVA组脾Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞的百分比显著低于对照组(P0.01),WPG组与OVA组相比有升高趋势,差异有统计学意义(P0.01)。结论双歧杆菌WPG可以增加食物过敏小鼠CD4+CD25+调节性T细胞数量,刺激细胞因子IL-10和TGF-β分泌。     

双歧杆菌的完整肽聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞缝隙链接的影响

目的探讨双歧杆菌的完整肽聚糖（WPG）对巨噬细胞缝隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）的影响。方法首先分离培养昆明小鼠腹腔巨噬细胞,然后以WPG刺激巨噬细胞,再用脂荧光探针标记细胞,最后采用激光共聚焦显微镜结合激光漂白后荧光恢复技术检测反映GJIC变化的荧光恢复程度。结果和对照组相比,以WPG刺激巨噬细胞后,其GJIC的平均荧光恢复率明显增加（P〈0.01）。结论双歧杆菌的WPG可提高巨噬细胞的缝隙连接介导的细胞间通讯。     

双歧杆菌的完整肽聚糖对大鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达的影响

目的探索双歧双歧杆菌的完整肽聚糖(WPG)对大鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的调控作用。方法以WPG刺激大鼠腹腔巨噬细胞;或以NF-κB的抑制剂NAC和ERK抑制剂PD98059分别预先孵育巨噬细胞,再用WPG刺激巨噬细胞,最后用RT-PCR检测巨噬细胞TNF-αmRNA的表达水平。结果 WPG刺激巨噬细胞后,其TNF-αmRNA的表达水平显著高于对照组(P0.01)。但经NAC和PD98059分别预先孵育巨噬细胞后,其TNF-αmRNA的表达水平均明显低于WPG刺激组(P0.01)。结论双歧双歧杆菌的WPG能上调巨噬细胞TNF-αmRNA的表达,这一过程受NF-κB和ERK的调控。     

双歧杆菌的完整肽聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞膜脂流动性的影响

目的探讨分叉双歧杆菌的完整肽聚糖（WPG）对巨噬细胞膜脂流动性的影响。方法首先分离培养昆明小鼠腹腔巨噬细胞,然后以WPG刺激巨噬细胞,再用细胞膜磷脂荧光探针标记细胞,最后采用激光共聚焦显微镜结合激光漂白后荧光恢复技术检测巨噬细胞的膜脂流动性。结果WPG刺激组反映小鼠腹腔巨噬细胞膜脂流动性的平均荧光恢复率明显高于对照组（P〈0.01）。结论分叉双歧杆菌的完整肽聚糖可提高巨噬细胞膜脂流动性。     

双歧杆菌的完整肽聚糖对小鼠腹腔巨噬细胞细胞骨架的影响

目的探讨双歧双歧杆菌的完整肽聚糖（WPG）对巨噬细胞细胞骨架的影响。方法首先分离培养昆明小鼠腹腔巨噬细胞,然后以WPG刺激巨噬细胞后,用荧光标记的鬼笔环肽染液染色,最后采用激光共聚焦显微镜技术检测巨噬细胞的细胞骨架。结果和对照组相比,WPG刺激巨噬细胞后,其胞内肌动蛋白减少且排列更加紊乱,同时胞膜荧光强度减弱,胞外放射状荧光物质减少,甚至消失。结论双歧双歧杆菌的WPG在激活巨噬细胞的过程中可影响其细胞骨架。     

双歧杆菌对哮喘儿童DC表达CD86和HLA-DR的影响

目的研究双歧杆菌对过敏性哮喘儿童外周血单个核细胞来源的树突状细胞（DC）表面表达CD86和HLA-DR的影响。方法从12例过敏性哮喘儿童和10例对照组儿童的外周血单个核细胞诱导生成未成熟DC,分别经双歧杆菌或细菌脂多糖（LPS）处理,用流式细胞仪检测各组DC表面CD86和HLA-DR分子表达。结果双歧杆菌刺激后,哮喘儿童DC表面CD86表达明显增高（P〈0．05）,HLA-DR表达无明显变化（P〉0．05）,对照组儿童CD86和HLA-DR表达无明显影响;LPS刺激可明显增加哮喘儿童和对照组儿童CD86和HLA-DR的表达。结论过敏性哮喘儿童DC表面CD86的表达可能存在缺陷,双歧杆菌能适度上调其表达,在DC的成熟过程中可能起调节作用。