木霉菌发酵羊胃容物产木聚糖酶的分离纯化及特性

目的:为城市屠宰场牛羊胃容物类的生物垃圾型可再生资源的潜在工业化开发应用(城市无害鲜生物垃圾变废为宝的低碳生物循环经济工程)提供了部分可靠科学依据.方法:M-112木霉菌固态发酵羊胃容物的粗酶提取液,经20～60%饱和度的硫酸铵粗分级分离、Sephadex G-25脱盐、Sephadex G-150到Sephadex G-100分子筛顺序纯化,通过蛋白质测定、酶活测定、SDS-PAGE和底物-PAGE电泳等.结果:制备到一种分子量约为64.7kDa的电泳纯木聚糖酶,其回收率为5.59%,纯化倍数10.43,比活力为253.36IU/mg.纯化出的木聚糖酶,经性质研究表明,其Km=11.20g/L,Vmax=0.70μmoL/min;最适温度为65℃,最适pH为6.0,该酶在中温条件下稳定性好,在酸性至弱碱性(pH 3.0～8.0)条件下稳定性好.结论:采用改良的凝胶色谱技术,首次纯化出木霉菌固态发酵羊胃容物所产的木聚糖酶.     

双歧杆菌对过敏性哮喘儿童树突状细胞分泌IL-10、IL-12等细胞因子的影响

目的探讨双歧杆菌对过敏性哮喘儿童外周血单核细胞（PBMC）来源的树突状细胞（DC）分泌IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和IFN-γ的影响。方法从15例过敏性哮喘儿童和15例非哮喘儿童的外周血单个核细胞诱导生成未成熟DC,加入双歧杆菌后继续培养DC2d,用ELISA方法检测培养上清中IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和IFN-γ的水平。结果双歧杆菌能明显刺激哮喘儿童DC分泌IL-12、IFN-γ,IL-1β及IL-6和非哮喘儿童DC分泌IL-12、IL-10、IL-1β及IL-23水平增高。结论双歧杆菌能够刺激过敏性哮喘儿童DC分泌IL-12和IFN-γ,可能改变Th2优势分化,纠正Th1／Th2失衡。同时双歧杆菌还能刺激哮喘儿童DC分泌IL-1p及IL-6增高,达到促进,Th17细胞分化的作用。     

β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达

目的:实现β-甘露聚糖酶基因在野生酵母菌中的整合诱导型表达。方法:克隆猪肠道野生酵母菌JSY4的25S rDNA片段;并与YIP5经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切连接,构建载体YIP5-rDNA。BamHⅠ与SalⅠ双酶切YIP5-rDNA,EcoRⅠ与SalⅠ双酶切pGEM-ManⅠ得到ManⅠ基因,BglⅡ与EcoRⅠ双酶切pPIC9K得到AOX1启动子,将三个片段连接,构建高拷贝整合诱导型表达载体YIP5-rDNA-AOX1-ManⅠ。提取DNA用SalⅠ单酶切线性化与pAX15按3∶1的比例共转化JSY4,在含300μg/mlG418的YEPD平板上筛选工程菌转化子,PCR方法鉴定。用2%甲醇诱导共转化工程菌以实现表达。结果:成功表达出β-甘露聚糖酶,其比活力为0.90IU/ml。而且传代10次后仍能检测到ManⅠ基因的表达产物β-甘露聚糖酶。结论:实现了β-甘露聚糖酶基因随共转化工程菌染色体稳定遗传及表达的目的。     

高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治疗前后肠道菌群变化

目的了解抗生素对肺炎婴幼儿肠道菌群多样性和结构的影响。方法选取5例1岁以内因轻度社区获得性肺炎住院的患儿,收集抗生素治疗前及治疗后第3~5天的粪便标本。利用Illumina MiSeq测序平台,对细菌的16SrRNA基因V3~V4区进行高通量测序,并对测序结果进行生物信息学分析。结果抗生素治疗后第3~5天婴幼儿肠道菌群的多样性明显下降。变形菌门的相对丰度在3例婴幼儿的肠道中下降;厚壁菌门的相对丰度在4例婴幼儿的肠道中下降;而拟杆菌门的相对丰度在4例婴幼儿的肠道中上升;厚壁菌门与拟杆菌门的比例下降。肠道内不动杆菌属、喜胆汁菌属、埃格特菌属、肠球菌属、支原体、颤螺菌属、紫单胞菌属、普雷沃菌属和真杆菌属增长1倍以上;奇异菌属、双歧杆菌属、黄杆菌属、乳酸菌属、链球菌属、萨特菌属和韦荣球菌下降超过50%。结论婴幼儿短期使用抗生素治疗肺炎后,肠道菌群的多样性下降,肠道微生态失衡。     

百日咳鲍特菌感染婴幼儿口咽部的菌群变化

摘要：目的 通过比较健康婴幼儿与百日咳鲍特菌感染婴幼儿口咽部的菌群相对丰度,探讨百日咳鲍特菌感染对婴幼儿口咽部的菌群影响。方法 采用高通量测序技术,对53例百日咳鲍特菌感染婴幼儿和21例健康婴幼儿口咽标本进行16S rDNA测序,对测序序列进行分析,比较两组间的菌群多样性及在门、属水平上菌群结构差异。结果 健康婴幼儿与百日咳鲍特菌感染患儿在性别和年龄方面差异没有统计学意义。百日咳鲍特菌感染婴幼儿比健康婴幼儿口咽部菌群多样性显著增加。变形菌门（Proteobacteria）作为主要的门在百日咳鲍特菌感染患儿组中相对丰度显著高于健康婴幼儿组;两组排在相对丰度前15位的属,共有3个主要的属在百日咳鲍特菌感染患儿中显著增加,分别为盐单胞菌属（Halomonas）、嗜血杆菌属（Haemophilus）和鲍特菌属（Bordetella）;而罗氏菌属（Rothia）显著减少。结论 百日咳鲍特菌感染婴幼儿口咽部的菌群发生了显著的变化,百日咳鲍特菌感染患儿口咽部的菌群多样性比健康婴幼儿显著增加,在门和属水平百日咳鲍特菌感染患儿与健康婴幼儿主要组成方面均有显著性不同。     

利用酯酶同工酶技术检测香菇双单杂交后代

选用香菇的野生株Ｑ 与栽培株苏香的四种孢子单核体进行完全亲和双单杂交,运用拮抗试验并辅以液体出菇试验初步鉴定出１２ 个杂交后代,且对杂交后代酯酶同工酶进行了检测,并以聚类分析方法分析了菌株间酯酶同工酶酶谱的结果,较直观本质地反映了杂交后代及其与亲本之间的遗传差异,表明１ —１２ 号菌株是真正的双单杂交后代,认为菌株间酯酶同工酶酶相似系数值可以作为香菇遗传育种选择亲本的辅助的遗传标记     

双歧杆菌对哮喘儿童DC表达CD86和HLA-DR的影响

目的研究双歧杆菌对过敏性哮喘儿童外周血单个核细胞来源的树突状细胞（DC）表面表达CD86和HLA-DR的影响。方法从12例过敏性哮喘儿童和10例对照组儿童的外周血单个核细胞诱导生成未成熟DC,分别经双歧杆菌或细菌脂多糖（LPS）处理,用流式细胞仪检测各组DC表面CD86和HLA-DR分子表达。结果双歧杆菌刺激后,哮喘儿童DC表面CD86表达明显增高（P〈0．05）,HLA-DR表达无明显变化（P〉0．05）,对照组儿童CD86和HLA-DR表达无明显影响;LPS刺激可明显增加哮喘儿童和对照组儿童CD86和HLA-DR的表达。结论过敏性哮喘儿童DC表面CD86的表达可能存在缺陷,双歧杆菌能适度上调其表达,在DC的成熟过程中可能起调节作用。     

五种益生菌菌株对脐血单个核细胞免疫作用的实验研究

目的比较不同剂量的5种不同益生菌菌株的免疫调节作用,为选择适当的菌株进行治疗提供依据。方法取7例健康孕妇的脐血分离出的脐血单个核细胞(cord blood monocular cells,CBMC),分别与长双歧杆菌6-1株、婴儿双歧杆菌CGMCC313-1株、嗜酸乳杆菌YIT2004株、粪链球菌YIT0072株和酪酸梭状芽胞杆菌CGMCC313-2株,以菌和CBMC比例2∶1(低)、20∶1(中)和200∶1(高)共培养24~36 h,同时设阴性对照(PBS)和阳性对照(脂多糖,LPS)。然后采用流式细胞仪检测各组CBMC表面CD4、CD25分子表达情况,用ELISA方法检测培养上清中IL-10、IL-12、IL-4、TGF-β1和IFN-γ的水平。结果 (1)与阴性对照(PBS)组相比,除200∶1比例的酪酸梭状芽胞杆菌CGMCC313-2株能够显著提高CBMC表达CD4CD25(10.45±3.16 vs 5.84±2.32,P=0.009)以外,其余益生菌菌株对表达CD4CD25差异均无统计学意义(P0.05)。(2)长双歧杆菌6-1株在中高剂量下,能够刺激CBMC产生IL-10和IFN-γ,对产生IL-12无明显影响。(3)婴儿型双歧杆菌CGMCC313-1株在各个剂量下均能够刺激CBMC产生IL-10,对IL-12和IFN-γ产生无明显影响。(4)酪酸梭状芽胞杆菌CGMCC313-2株在中高剂量下,能够刺激CBMC产生IL-10,对IL-12和IFN-γ产生无明显影响。(5)粪链球菌YIT0072株在低中剂量下,能够刺激CBMC产生IL-10、IL-12和IFN-γ,而高剂量则无影响。(6)嗜酸乳杆菌YIT2004株在中高剂量下,能够刺激CBMC产生IL-10,在中剂量下,能够刺激CBMC产生IFN-γ,对IL-12无影响。(7)在本研究中均未能检测出IL-4和TGF-β1。结论在目前国内使用的益生菌菌株中,仅酪酸梭状芽胞杆菌CGMCC313-2株能够显著提高CBMC表达CD4CD25。5种菌株均能够刺激CBMC产生抗炎症因子IL-10;长双歧杆菌6-1株、粪链球菌YIT0072株和嗜酸乳杆菌YIT2004株能够刺激CBMC产生Th1型细胞因子INF-γ,仅粪链球菌YIT0072株能够刺激CBMC产生IL-12。各个菌株在不同的剂量下,具有不同作用。提示在应用益生菌治疗免疫等相关性疾病时,应该考虑不同菌株对免疫细胞的不同作用机制。     

肺炎支原体肺炎患儿口咽部菌群的改变

目的比较健康儿童与肺炎支原体肺炎患儿口咽部菌群的差异,分析肺炎支原体感染对儿童口咽部菌群变化的可能影响。方法采用高通量测序技术,对30例肺炎支原体肺炎患儿及30例健康儿童16SrDNA进行测序分析,比较两组间的菌群多样性及在门、属水平上菌群结构差异。结果健康儿童与肺炎支原体肺炎患儿在性别、年龄、抗生素使用等方面差异无统计学意义。肺炎支原体肺炎患儿口咽部菌群多样性比健康儿童明显降低。在门水平上,Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)和Fusobacteria(梭杆菌门)在健康儿童中相对丰度显著高于肺炎支原体肺炎患儿组,而Firmicutes(厚壁菌门)、Tenericutes(柔膜菌门)和Actinobacteria(放线菌门)在肺炎支原体肺炎患儿组中相对丰度均显著高于健康儿童组;在属水平上,两组排在相对丰度前10位的属差异具有统计学意义,共有6个属在肺炎支原体肺炎患儿中显著增加,分别为Staphylococcus(葡萄球菌)、Actinomyces(放线菌属)、Acinetobacter(不动细菌属)、Atopobium(阿托波菌属)、Corynebacterium(棒状杆菌)和Abiotrophia(营养缺陷菌属)。结论肺炎支原体肺炎患儿口咽部菌群存在明显的改变,其口咽部菌群多样性比健康儿童明显降低,在门、属水平肺炎支原体肺炎患儿与健康儿童差异均有统计学意义。     

湿疹患儿肠道菌群高通量测序初步探索

目的为了解湿疹患儿肠道菌群的结构与湿疹之间的关系,通过对湿疹患儿和健康儿童粪便样本细菌总DNA提取,利用高通量测序技术,比较健康儿童和湿疹患儿肠道菌群的异同。方法 10例年龄在2个月~2岁婴幼儿由皮肤科门诊确诊为湿疹伴有过敏性疾病家族史作为研究对象,年龄和性别相当健康儿童10例作为对照,分别收集其粪便标本并提取所有样本中细菌的总DNA,对16SrRNA基因进行高通量测序,获得两组的肠道菌群结构数据并进行菌群差异性分析。结果通过Roche 454高通量测序,两组肠道微生物菌群多样性指数比较差异无统计学意义。两组主要由Firmicutes(厚壁菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Proteobacteria(变形菌门)和Actinobacteria(放线菌门)4个门组成;两组在门水平上进行菌群结构比较,差异无统计学意义。两组样本在属水平上共获得200个不同属的细菌,其中Bacillus(芽孢杆菌属)、Bilophila(噬胆菌属)、Christensenella(纺锤状细菌属)、Coprobacillus、Eikenella(艾肯菌属)、Enterobacter(肠杆菌属)、Eubacterium(真杆菌属)、Lactococcus(乳球菌属)、Megamonas(巨单胞菌属)、Leuconostoc(明串珠菌属)、Morganella(摩根菌属)、Rhizobacter(根杆菌属)、Proteus(变形菌属)、Sutterella(萨特菌属)、Veillonella(韦荣球菌属)、Akkermansia、Anaeroglobus、Anaerotruncus、Butyricicoccus、Epulopiscium、Gordonibacter、Lachnospiraceae uncultured、Robinsoniella和Varibaculum共24个属在两组间差异具有统计学意义。结论湿疹患儿肠道菌群与健康儿童相比,菌群多样性指数(Shannon指数和Simpson指数)未见明显差异,但在菌群结构上发生了一些变化,某些特别的细菌菌属存在显著性差异。