蔗糖酶和葡萄糖氧化酶的共固化

＃ 本文研究了用吸附交联技术共固定化蔗糖酶和葡萄糖氧化酶(GOD)的方法,考查了共固定化酶的动力学性质。试验结果表明:与溶液酶相比较,固定化蔗糖酶和GOD的响应滞迟期分别为3分钟和2分钟,稳态响应时间增加了6分钟和4分钟,Km值增大,pH—活力曲线变宽,最适pH值分别增大0.7和0.64,最适温度则降低7.3℃和16℃。 以活性氧化铝作载体,戊二醛作交联剂制备的共固定化蔗糖酶和GOD,其蛋白质固定化率为62.9％,分解葡萄糖的总速度为441.6IU,当蔗糖浓度为0.2％,以内时其反应速度与蔗糖的浓度呈正相关(r=0.996),使用半衰期1623次,在4℃下保存120天活力残存为83.7％。     

白兰瓜子叶衰老过程中蔗糖酶同工酶的分离及其活性变化

利用DEAE—纤维素柱层析对白兰瓜子叶蔗糖酶同工酶进行了分离。发现细胞质可溶性部分含有4种蔗糖酶同工酶,其中3种为酸性蔗糖酶(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ),其活性最适pH分别为5.40、4.30和4.73;另外一种为碱性蔗糖酶,其最适pH为7.40。细胞壁盐溶性部分仅含1种酸性蔗糖酶,其最适pH亦为4.73。在白兰瓜子叶生长后期(7～11d),定位于细胞质的酸性蔗糖酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的活性略有升高;衰老发生后(17～23d)其活性显著下降;衰老后期碱性蔗糖酶活性消失。在子叶生长和衰老期间细胞壁酸性蔗糖酶活性则一直下降。     

蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的表面展示及酶学性质分析

【目的】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶催化1分子蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上,形成1-蔗果三糖和葡萄糖。在低聚果糖中,1-蔗果三糖益生素活性最高。本研究将该酶展示在酵母菌细胞表面上,并用于1-蔗果三糖的制备。【方法】将来自莴苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因克隆到用于酵母细胞表面展示的表达载体上,并在解脂亚罗酵母菌中进行异源表达,表达的酶展示在该细胞表面上,然后以蔗糖为底物,研究表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的性质。【结果】免疫荧光实验结果表明蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶已展示在酵母菌的细胞表面上,高效液相色谱结果表明酵母表面展示的该酶具有转移酶的催化活性。该酶的最适作用温度、最适作用p H分别为45°C和7.5;该酶的催化活性受Zn2+和Cu2+的抑制,受Ca2+激活;该酶重复使用7次后,酶活下降50%。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶和3%蔗糖混合后在40°C条件下孵育30 min后,所产1-蔗果三糖含量最高为20.8 mmol/L。【结论】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶在解脂亚罗酵母菌中得到成功表达,并展示在其细胞表面上,生化研究表明该重组蛋白具有果糖基转移酶活性,且催化蔗果三糖的生成。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶作为一种全细胞催化剂能够用于1-蔗果三糖的制备。     

蔗糖酶和GOD的共固定化研究

本文研究了用吸附交联技术共固定化蔗糖酶和葡萄糖氧化酶（ＧＯＤ）的方法,考查了共固定化酶的动力学性质。试验结果表明：与溶液酶相比较,固定化蔗糖酶和ＧＯＤ的响应滞迟期分别为３分钟和２分钟,４态响应时间增加６分钟和４分钟,Ｋｍ值增大,ｐＨ─活力曲线变宽,最适ｐＨ值分别增大０．７和０．６４,最适温度则降低７．３℃和１６℃。以活性氧化铝作载体,戊二醛作交联剂制备的共固定化蔗糖酶和ＧＯＤ,其蛋白质固定化率为９２．９％,分解葡萄糖的总速度为４４１．６ＩＵ,当蔗糖浓度在０．２％以内时其反应速度与蔗糖浓度呈正相关（ｒ＝０．９９６）,使用半衰期１６２３次,在４℃下保存１２０天活力残存为８３．７％。     

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的纯化及其性质

[目的]研究工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-dexYG产右旋糖酐蔗糖酶的纯化和酶学性质.[方法]工程菌经过IPTG诱导后生产含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶,通过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究.[结果]经过SDS-PAGE测得该酶的分子量约为170 kDa,与理论推测值基本相同.以蔗糖为底物,酶促反应的最适温度为25～30℃,最适pH值为5.4,动力学常数Km值为10.43 mmol/L;酶活在pH 5.0～8.0较为稳定,在室温(25 ℃)保藏4天仍有59%的酶活力,4℃保存7周酶活力仅下降一半,但在35℃以上失活很快;Ca2 对催化作用有较大的促进,Mg2 有微弱的促进作用,K 对催化反应无影响,Cu2 的抑制作用最强.其他试剂对重组酶的活性有不同程度的影响,其中SDS抑制作用很强.[结论]研究为重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶的获取、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数.     

游离及固定化果糖基转移酶部分酶学性质的比较研究

 从诱变、筛选的米曲霉GX0 0 10菌株所产生的果糖基转移酶 ,经过纯化和固定化操作分别制备游离酶和固定化酶 ,对两者的酶学性质进行了比较研究 .结果表明 ,两者在蔗糖转化为蔗果低聚糖的酶促反应中 ,最适pH为 5 5,在pH5 0～ 7 5之间酶活性相对稳定 .游离酶和固定化酶的适宜温度范围分别是 4 5～ 52℃和 4 0～ 55℃ .在 55℃保温 60min ,酶活性保存率分别是 61 6%和 87 5% .固定化酶的热稳定性提高 .0 1mmol LHg2 +和 1mmol LAg+能完全抑制游离酶的活性 ,但只能部分抑制固定化酶的活性 ,1mmol L的Ti2 +能完全抑制两者的活性 .以蔗糖为底物时 ,游离酶的米氏常数Km=2 15mmol L ,而固定化酶Km =386mmol L .游离酶只能使用一次 ,固定化酶反复使用 54次后 ,剩余活力为 55 2 % .用 55% (W V)蔗糖溶液与固定化酶在pH5 0 ,4 6℃下作用 12h ,可获得61 5% (总低聚糖 总糖 )产物 ,其中蔗果五糖含量达到 7 2 % .     

测蔗糖复合酶电极的研究

采用酶电极流动注射分析系统(EFIA),由固定化酶膜包括蔗糖转化酶(INV),葡萄糖变旋酶(MuT)及葡萄糖氧化酶(GOD)与氧电极共同组成的复合酶电极用于蔗糖的快速测定。实验确定每张酶膜的最适酶量(Iu比)为lNV：MUT：GOD：72：48：2．4。酶经固定化后,INV与MUT的综合回收活力>42．9％。其最适pH为5．8—6．5。最适温度范围是35—45℃。动态法和稳态法测试的线性范围分别为：5×10^-4—10^-1和10-5—2×10^-3mol／L,响应时间分别<20s和<2 min。实验的重复性良好,变异系数<1．7％。用此酶电极测定以蔗糖为碳源的发酵液中的蔗糖含量,平均回收率达到98％。发酵液中的蔗糖分解产生的葡萄糖对本电极的干扰可通过平行运行的GOD电极来校正。连续使用的寿命至少为120h。比前年报道的14th有了显著的提高。酶膜显示了较好的保存稳定性(30天,保存于4℃蒸馏水中)和一定的抗热性(50℃,30min)。     

蔗糖脂肪酸脂对离体和活体大豆蔗糖酶活力和构象的影响

研究了蔗糖脂肪酸脂(SFE)对离体和活体大豆蔗糖酶活力和构象的影响。当SFE的浓度大于1.0mmol/L后,开始激活离体蔗糖酶的活力。在大豆的开花期和结荚期,SFE可以增加蔗糖酶的活力。荧光实验结果表明,在小于2mmol/L时,SFE不改变蔗糖酶的荧光最大发射峰峰位和峰高。施用SFE后,大豆叶片中果糖、葡萄糖和蔗糖酶的含量,分别是对照的170%±10%,190%±10%,和260%±20%;而蔗糖的含量几乎不变。对蔗糖酶 的SDS-凝胶电泳图进行扫描分析的结果表明,经SFE处理后的蔗糖酶含量比对照高两倍左右。这些结果说明SFE可以显著增加活体蔗糖酶的活力,但活力的增加既不是因为蔗糖酶构象的改变,也不是蔗糖(作为底物)诱导所致,而是SFE增加了大豆叶片中蔗糖酶的含量引起的。     

Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌产右旋糖酐的影响

肠膜状明串珠菌在其产生的右旋糖酐蔗糖酶的作用下,以蔗糖为原料转化合成右旋糖酐和产生果糖。着重进行了Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐影响的初步探索。对Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长,产果糖、右旋糖酐和右旋糖酐蔗糖酶,右旋糖酐蔗糖酶作用影响进行了研究。一定浓度的Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226的生长具有促进作用; Mn~(2+)抑制肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产果糖和右旋糖酐,且Mn~(2+)浓度越高,抑制性越强; Mn~(2+)对肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶有抑制作用; Mn~(2+)对右旋糖酐蔗糖酶具有较强的激活作用,激活作用可达158%,最适Mn~(2+)浓度为5. 0 mmol/L。     

蔗糖代谢相关基因转化植株的研究进展

蔗糖代谢关键酶主要有蔗糖酶(转化酶)、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶.本文对这些酶编码基因的转化植株的特性作了介绍,并对需进一步研究的问题进行了讨论.     

食品上的应用

924233用固定化的完整酵母细胞生物催化剂酶促水解蔗枪〔英]/Hasal,P.…/Enzyme Mierob.Te-ehnol一1992,14(3)一221~229〔译自DBA,1992,11(8),92一04582」 通过将面包酵母细胞与聚乙烯亚胺和戊二醛共价结合制备了具有转化酶(刀一D一吠喃果糖普酶)活性的新的粒状固定化生物催化剂,无需用固体支持物。生物催化剂比活性为300~15o0U/g、最适pH为4.6。60~75℃时的半衰期为500~1000小时。65℃以下蔗糖水解的活化能为36.2KJ/kmol。底物浓度高于1.。~1.5M对反应有抑制作用(与颗粒大小有关)。在生物催化剂半衰期内水解蔗糖的总产率为2000~l000o…     

产菊糖酶克鲁维酶母Y-85的明胶固定化

克鲁维酵母Ｙ－８５的胞外菊糖酶占其总酶活的２８％,以１０％明胶包埋该酵母,酶活保留率为７３．９％。与游离细胞相比,固定化细胞菊糖酶的最适ＰＨ未改变,但当ＰＨ〈４和ＰＨ〉７时酶活稳定性更高;最适水解温度则升高了５℃,酶的热稳定性也有所提高。游离细胞的Ｋｍ值为９．３ｍｍｏｌ／Ｌ,固定化细胞则为１２．８ｍｍｏｌ／Ｌ。４℃贮存３０ｄ,固定化细胞酶活无损失,分批反应１０批次,固定化细胞酶活及机械强度保持良好     

固定化青霉素G酰化酶水解头孢菌素G制备7—ADCA的研究

用聚丙烯腈纤维固定化青霉素酰化酶水解头孢菌素G制备7-ADCA,固定化酶对头孢菌素G的最适pH为9.0,最适温度50℃。在37℃、pH8.0固定化酶对头孢菌素G的表观米氏常数为1.67×10~(-2)mol/L。最大反应速度为3.01mmol·g~(-1)·min~(-1)。头孢菌素G溶液浓度在2％以上时,对固定化酶有明显的抑制作用。固定化酶水解头孢菌素G的最佳投料浓度为5％～6％,水解时用酶量以每克头孢菌素G投300U以上为好。按上述条件水解头孢菌素G,操作25批后固定化酶保留活力77.8％,7-ADCA平均收率92.68％。     

固定化在多孔玻璃上的青霉素酰化酶性质

从大肠杆菌As 1．76提取青霉素酰化酶,经纯化,用戊二醛圈定在氯烷基硅烷化多孔玻璃上。初步摸索了固定化条件。固定化酶的米氏常数为7．7 x 10^-4M,比自然酶大10倍,但竞争性抑制剂苯乙酸对固定化酶和自然酶的抑制常数基本相同,固定化酶的最大反应速度为5．8×10^-2M／min,比自然酶大2．5倍,水解NIPAB的最适pH为7．O,比自然酶低1个pH单位,最适反应温度比自然酶低i0℃,固定化酶在pH 5．8—8．0之间较稳定,较自然酶的范围略窄;固定化酶在40℃以下稳定,而自然酶在45℃以下稳定。     

阴沟肠杆菌GX-3的中性蔗糖酶在大肠杆菌中的表达及其特性鉴定

【目的】在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)GX-3中发现了一个编码中性p H范围内起作用的蔗糖酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行克隆表达及纯化,并研究该蔗糖酶的酶学性质,为蔗糖酶的应用研究及开发利用奠定基础。【方法】通过查找Gen Bank数据库中来自阴沟肠杆菌同属中的编码蔗糖酶的基因序列,对这些序列进行比对分析设计简并引物扩增保守区;利用PCR扩增目的基因,以p QE30为表达载体构建重组质粒;镍亲和层析纯化重组蛋白,对重组酶的酶学性质进行详细研究。【结果】一个编码蔗糖酶的基因(Einv)被从阴沟肠杆菌GX-3中发现和克隆。生物化学特性鉴定表明这个蔗糖酶的活性最适温度为40℃和最适p H为6.5。凝胶渗透色谱法分析显示Einv是以二聚体的形式存在。Einv这个蔗糖酶在1170 mmol/L的蔗糖条件下仍保留有80%以上的水解活性。而在高浓度的蔗糖条件下,Einv只有水解活性而没有转糖基的副反应发生。它能够水解棉子糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和水苏糖。【结论】获得的Einv是一个在中性p H范围内起作用的β-呋喃果糖苷酶,只有水解功能而没有转糖基功能。这些特性表明这个中性蔗糖酶在食品工业具有重要的应用价值。     

黑曲霉菊糖酶的纯化及性质

黑曲霉(Aspergillus niger)319发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素52离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析,得到了电泳纯的菊糖酶组分。提纯倍数为67,收率为25.5％。菊糖酶的最适pH为5.0,最适温度为60℃。此酶为单亚基蛋白,凝胶过滤法测得分子量为28000,含糖13.9％,用等电聚焦法测得等电点为5.4,该酶对温度有较高的稳定性,对pH的稳定范围较窄。Hg²⁺、Pb²⁺和Cu²⁺对该酶有强烈的抑制作用。此酶对菊糖有较强的底物专一性,产物为果糖,但它也可作用于蔗糖,I/S值为0.348。当以菊糖为底物时,K_m为6.25mmol/L,V_m为67.11 μmol·mg~(-1)·min~(-1)。     

青春双岐杆菌中β-呋喃果糖苷酶的提纯和一些性质

双岐杆菌是革兰氏阳性、不产芽孢的厌氧菌,主要存在于人和一些动物的肠道中,具有阻止有害细菌滋生和感染的作用。双岐杆菌能选择性水解低聚果糖,而哺乳动物的消化酶不能水解低聚果糖。 微生物中的β—呋喃果糖苷酶可分为两类,一类为蔗糖酶,它能水解蔗糖但不水解菊糖;另一类为外菊糖酶(β-果糖苷酶),它不仅水解蔗糖也能水解菊糖,它们对蔗糖和菊糖的活性比相差甚大。有些青春双岐杆菌提取物水解1-蔗果三糖的速度比蔗糖和菊糖快,并能从1-蔗果三糖产生果糖和蔗糖。青春双岐杆菌G-1菌株的提取物对1-蔗果三糖的活性很高,当底物浓度各为5mM时,它对1-蔗果三     

谷胱甘肽硫转移酶(GST)的固定化及酶学特性研究

对谷胱甘肽硫转移酶的固定化、游离酶和固定化酶的酶学特性进行了研究,通过试验,确定谷胱甘肽硫转移酶的最佳固定化条件为先用2％壳聚糖吸附酶,然后再加戊二醛交联,交联用戊二醛浓度为1．2％,交联时间6h;游离酶的最适温度为45—55℃,最适pH值为6．5-7．0：固定化酶的最适温度为45-50℃,最适pH值为7．0;游离酶和固定化酶的最适酶促反应时间为30min。     

蔗糖-葡萄糖双功能酶传感器的研究

结合蔗糖转化酶(INV)酶管与葡萄糖氧化酶(GOD)-葡萄糖变旋酶(MUT)双酶电极构成一种新的蔗糖传感器。该传感器可以分别用于蔗糖及葡萄糖的测定。蔗糖经酶管作用产生α-D-葡萄糖,再用COD-MUT双酶电极定糖。若是样品中蔗糖和葡萄糖共存,比较样品流经不同路径(Ws和Wg)时传感器的响应值,可以排除葡萄糖对蔗糖测定的干扰。传感器的最适pH和温度范围分别为:5.0—6.5和30—40℃。在稳态法实验中,传感器的线性范围为:2.5×10~(-4)—5×10~(-3)mol/L。传感器的重复性很好,CV<1％。该传感器在用于测定发酵培养基(含葡萄糖)的蔗糖含量,平均回收率为97.9％。传感器与糖度计法测定的相关系数为0.997。传感器至少可以稳定使用8天以上。     

产3-甾酮-△1-脱氢酶的简单节杆菌固定化细胞的制备及其性质

研究了产3-甾酮△1-脱氢酶的简单节杆菌(Arthrobacter simplex) By-2-13细胞包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的制备条件。用5ml 5％丙烯酰胺凝胶包埋lg湿细胞为宜,固定化后酶活力回收率为80％左右。添加0.01％的维生素K,固定化细胞酶活力可提高40％左右。固定化细胞和自然细胞酶的最适温度分别为35℃;和30℃,米氏常数前者为0．417mM,后者为0．33mM。固定化后热稳定性比自然细胞好,其他性质基本相同。