蚓激酶研究进展

蚓激酶是一种新型的溶栓制剂,具有良好的溶血栓治疗效果。综述了至今为止分离到的蚓激酶成分、生物学活性、药物学作用、抑制剂和空间结构分析等方面的研究进展 。     

蚓激酶的研究进展

概述了蚓激酶的分离纯化、理化特性、纤溶特点及临床应用等方面的研究进展.     

蚓激酶基因F238在大肠杆菌中的可溶性表达

应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因F238,并将其克隆至大肠杆菌质粒pET22b-TrxA中,构建双顺反子表达载体p17rx-F238.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/LIPTG、30℃条件下诱导6 h,经SDS-PAGE证实蚓激酶成熟肽蛋白获得了高效表达,所表达的蛋白产物相对分子量与预期...     

TAME法对康脂口服液中蚓激酶单位效价的测定

用对甲苯磺酰-L-精氨酸甲脂法(以下简称为TAME法)对康脂口服液中蚓激酶单位效价进行测定研究,经多批次产品的测定结果表明,其蚓激酶单位效价均在1.5u/ml以上.本测定方法快速简便,适宜生产中控制产品质量,进一步指导生产.     

重组逆转录病毒介导的转蚓激酶基因兔

目的通过重组逆转录病毒介导获得转蚓激酶基因家兔。方法将含有蚓激酶基因的表达盒插入到逆转录病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载体,利用脂质体转染PA317包装细胞,G418进行筛选得到了阳性细胞克隆,克隆扩大培养后病毒上清直接注射雄性兔的睾丸组织转染精原干细胞。结果病毒上清经NIH3T3细胞进行滴度测定,最高滴度为1×104CFU/mL。病毒注射3月龄兔睾丸组织,过1.5个月取其睾丸、肾、脾、肝、肺进行组织切片观察,结果正常。提取交配所得F0、F1代仔兔基因组,经PCR、Southern检测,转基因阳性率F0代为6.3%(2/32)、F1代为15.3%(2/13)。结论通过重组逆转录病毒直接注射3月龄兔睾丸组织可获得转基因兔,病毒对兔的脏器无损害。     

蚓激酶对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生物学功能和MMP2、MMP9表达的影响

目的:考察蚓激酶对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)生物学功能影响,初步阐明其防治瘢痕疙瘩作用机制。方法:选取人KF为体外实验模型,随机分为对照组和蚓激酶低、中、高剂量组;应用药物干预48 h后,采用CCK8法测定人KF增殖率,流式细胞术检测凋亡率,划痕法测迁移能力,Western blot检测MMP2、MMP9蛋白表达。结果:与对照组相比,应用5 U·mL~(-1)、10 U·mL~(-1)和20U·mL~(-1)蚓激酶溶液干预后,人KF增殖率明显降低,凋亡率显著升高,在一定范围内与剂量成正相关性;与对照组相比,蚓激酶组的划痕距离均有不同程度地增加,MMP2、MMP9表达也显著下降,均有显著性差异。结论:蚓激酶可调节人KF的生物学功能,通过抑制细胞增殖和迁移、诱导凋亡、下调迁移相关蛋白MMP2、MMP9表达,防止瘢痕疙瘩的生长和侵润,为蚓激酶的进一步开发和利用提供有力支持。     

双顺反子翻译偶联表达载体的构建及蚓激酶基因F238在大肠杆菌中的可溶性表达

为了实现外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,利用硫氧还蛋白作为分子伴侣构建双顺反子翻译偶联表达载体pDICT。将大肠杆菌硫氧还蛋白基因插入到pET22b载体NdeI和EcoR I位点之间,同时在硫氧还蛋白编码基因的终止密码子前加入核糖体结合位点,构建成双顺反子翻译偶联表达载体pDICT。将蚓激酶基因F238克隆到该载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。SDS-PAGE结果表明,所表达的蚓激酶F238是可溶性蛋白。利用血纤维蛋白法对表达产物进行活性测定,重组蚓激酶F238不仅具有纤溶酶活性,而且具有激活纤溶酶原的激酶活性。该双顺反子翻译偶联表达载体的构建,为在大肠杆菌中可溶性表达外源蛋白提供了新方法。     

蚓激酶基因的人工合成及山羊乳腺表达

为了实现蚓激酶在真核细胞的高效稳定表达 ,人工合成了全长 849bp ,不含罕用密码子的蚓激酶F-Ⅲ-1cDNA序列 ,并以其为目的基因 ,构建以山羊β-酪蛋白启动子为上游调控序列的乳腺组织特异性表达载体pBLK和重组逆转录病毒表达载体pLN-bCP-LK。质粒pBLK 40 0 μg直接注入稳定泌乳期奶山羊乳腺 ,以纤维蛋白平板溶圈法 (FAPA)检测奶样纤溶活性。结果显示 ,注射后 3～ 60h ,奶样有明显纤溶活性 ,其中 6～ 9h活性最高。脂质体介导质粒pLN-bCP-LK转染PA317细胞系 ,5 0 0mg/LG418筛选后获得 4株高产毒细胞系 ,产毒滴度达 1× 1 0 ⁴～ 1× 1 0 ⁵CFU/ml水平。产毒细胞上清 1 0ml直接注入临产前两周的山羊乳腺 ,隔日以等量再注 1次 ,产羔后其奶样即有明显纤溶活性 ,注后第 45日纤溶活性仍无明显降低。     

蚓激酶在慢性乙型肝炎治疗中的潜在作用

纤连蛋白(FN)是参与乙型肝炎病毒感染和肝脏纤维化的重要分子。 蚓激酶(LK)是从赤子爱胜蚓(Eisenia foetide)中提取的一组蛋白水解同工酶,能水解纤维蛋白治疗凝血相关疾病。 从这组同工酶中分离纯化出单一活性成分,在体外可降解纤连蛋白,被命名为蚯蚓纤连蛋白水解酶(EFNase)。 然而,LK 能否预防乙型肝炎病毒感染以及缓解因乙型肝炎导致的肝脏损伤等问题还不清楚。本研究以人肝癌细胞系HepG2.2.15为细胞模型,观察LK 对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或 FN 水平的影响;以 C57BL / 6J-HBV 转基因小鼠为动物模型,探讨 LK 对小鼠血清中 HBsAg、FN、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平及肝脏病理改变的影响。结果表明,LK 在体内外均能抑制HBsAg 的生成,降低血清和肝脏FN。与生理盐水处理组相比,LK 改善了肝脏的状态。这些数据为理解LK 作为治疗乙型肝炎的潜在有效药物的治疗作用提供了有价值的信息。     

蚓激酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

以赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)体内的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增含自身信号肽的蚓激酶基因F238,将其克隆到pUCm-T载体上,并进行测序。GenBank登录号为:DQ202401。测序结果表明基因全长为738bp,共编码245个氨基酸,包括7个氨基酸的信号肽序列和238个氨基酸的成熟肽序列。与粉正蚓(Lumbricus rubellus)F-III-2相比,核苷酸与氨基酸序列的同源性均为99%,仅存在2个碱基的差异,导致2个氨基酸的突变。通过生物信息学方法对蛋白质的理化及结构特性进行分析预测,F238的等电点为4.61,含有11个半胱氨酸,形成3个二硫键。蛋白质分子主要由β折叠组成,具有丝氨酸活性中心,属丝氨酸蛋白酶超家族胰蛋白酶类。以重组质粒pUCm-T-F238为模板,通过PCR方法扩增去信号肽的蚓激酶基因F238-m,构建毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9-F238-m,将其线性化后用电穿孔法导入酵母宿主菌GS115中。在MM和MD平板上筛选表型,经甲醇诱导后,SDS-PAGE分析显示表达产物的分子量为28kDa左右,纤维平板法测定活力最高可达100U/mL。     

研究报告：蚓激酶同工酶降解乙型肝炎抗原并保护肝功能

目的蚓激酶同工酶(LKIs)作为肠溶胶囊的有效成分,用于治疗血栓性疾病已有30多年历史。近年来,LKIs在其他危重疾病中的研究时有报道。本文关注LKIs在乙型肝炎方面的作用。方法乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)分别与不同浓度LKIs孵育,观察这些蛋白质的降解和估计肽链的切割位点。Hep G2.2.15细胞与LKIs孵育,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹(Western blotting)检测细胞分泌的HBsAg和HbeAg。LKIs灌胃Balb/c小鼠30天,采用ELISA和Western blotting检测其血清HBsAg和HBeAg,免疫组化染色检测肝组织中的HBcAg。采用苏木精-伊红染色分析乙肝病毒转基因小鼠肝组织的损害,并通过ELISA定量分析血清谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)。腹腔注射后,取大鼠血清和肝组织,测定其中的LKIs含量,从而观察LKIs的吸收。采用LKIs给龙岩麻鸭灌胃30天,通过PCR检测其血清HBV DNA。结果蚓激酶肠溶胶囊的有效成分是含有6种LKIs的复方蛋白酶药物,可以降解HBV...     

百奥蚓激酶胶囊治疗缺血性卒中在上海市的临床观察

百奥蚓激酶胶囊治疗缺血性卒中在上海市的临床观察百奥蚓激酶胶囊是国家二类西药新药,具有降低血液粘稠度、溶栓等作用,适用于防治血栓类疾病．１９９５年,上海医科大学附属中山医院（３０例）、第二军医大学附属上海长征医院（１５例）、上海第二医科大学附属瑞金医院...     

蚓激酶的克隆及其对BHK细胞的作用

蚯蚓具有活血化瘀的功效 ,在我国作为中药 (地龙 )使用已经有上千年的历史 .近年来发现蚯蚓体内存在溶血栓成分 ,称为蚓激酶 (ｌｕｍｂｒｕｋｉｎａｓｅ)或蚯蚓纤溶酶 (ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｉｎｅａｒｔｈｗｏｒｍ) .自Ｎ .Ｎａｋａ ｊｉｍａ报道从蚯蚓中分离到蚓激酶以来[1] ,国内外已经有许多报道[2～ 6] ,主要侧重于天然提取物的生化研究 .本文通过ＲＴ ＰＣＲ从蚯蚓 (Ｌ .ｂｉｍａｓｔｕｓ)体内获得蚓激酶基因 ,进行表达并观察其对ＢＨＫ细胞的作用 .1　材料与方法1 1　材料正蚓科双胸蚓属蚯蚓 ;反转录试剂 ,质粒ｐｃ…     

利用泌乳乳腺鉴定真核基因表达的研究

为了找到一种新的可用于基因及其表达调控元件鉴定的方法,本试验以蚓激酶(LK)作为目的标志基因,分别构建了在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、逆转录病毒长末端重复序列(LTR)和beta-酪蛋白启动子调控下的三种真核表达载体pICLK、pLLKSN和pIbLK。制备各重组质粒后,以泌乳期羊乳腺作为支持系统,在处于稳定泌乳阶段分别注射400~800μg重组质粒于山羊乳腺组织中。在注射后不同时间采集奶汁,检测纤溶活性。结果显示,蚓激酶的不同重组质粒在注射到乳腺组织之后迅速得到表达,注射后6~9h蚓激酶表达量达到高峰,并可持续至72h以上;不同表达载体间表达量略有变化,但无显著差异。这些结果表明,利用泌乳乳腺组织表达真核蛋白是鉴定真核基因表达快速有效的手段之一。     

光散射法测凝血酶、水蛭素及蚓激酶活性

用纤维蛋白原作底物,加入一定量的凝血酶,监测在４８０ｎｍ处光散射强度变化,其变化过程是具有弛豫过程的Ｓ型曲线。取其最大斜率在一定时间（１ｍｉｎ）内的截距计算该酶的活力。在一定浓度的纤维蛋白原溶液中,光散射强度的变化速度与加入的凝血酶量成正比。在一定的纤维蛋白原和凝血酶的浓度下,加入水蛭素或蚓激酶,会减低光散射强度的增加速度,且加入量与光散射强度的变化速度成反比。因此,可用测光散射强度的变化速度来测定凝血酶,水蛭素和蚓激酶的活力。     

“细菌移位”还是“细菌易位”？

关于“Bacterial translocation”的研究虽已有几十年的历史,但是国内文献对将“Bacterial Translocation”翻译为“细菌移位”还是“细菌易位”还一直存在广泛争议。为对“Bacterial Translocation”的准确翻译提供理论依据,本文阐明了其研究背景及定义、发生机制及生物学意义;系统总结了国内文献中“细菌移位”和“细菌易位”的使用现状,从中文词义和生物学过程2个角度探讨了“Bacterial Translocation”对应的中文翻译;最终认定翻译为“细菌移位”更准确、认可度更高、更有利于推进相关研究的规范化。     

“严谨反应”还是“严紧反应”?

“Stringent response”是指细菌在遭受营养饥饿与环境胁迫时,由代谢酶RelA/SpoT催化合成信号分子鸟苷四/五磷酸[(p)ppGpp],从而诱导细菌细胞关闭rRNA、tRNA及核糖体蛋白基因转录,停止多种蛋白质的翻译,严控大部分代谢活动的一系列适应性基因表达过程。“Stringent response”几乎是所有细菌应对逆境的重要调节机制。目前,国内文献对“stringent response”的中文翻译存在“严谨反应”和“严紧反应”混用的现象。基于此,本文对“stringent response”的调控机制、生理功能及字面含义进行了分析,认为“stringent response”翻译为“严紧反应”更为合理、准确。     

针刺“八邪”、“八风”穴治疗蛇伤探讨

我院从1981年5月～2009年10月共治疗长白山蝮蛇咬伤患者450例,作者采用针刺“八邪”、“八风”穴以解毒排毒治疗毒蛇咬伤,取得满意疗效,现报告如下。     

“胃气”对成年人重症肺炎预后的影响

目的探讨中医“得胃气者生”的理论对重症肺炎预后的影响及在临床的应用。方法对本院2001～2007年收治住院的重症肺炎患者76例进行回顾性分析,统计患者消化道症状,计算患者所需能量和实际补充能量,将患者分为营养治疗不充分组（A组）和营养治疗充分组（B组）,并观察两组的临床效果及预后。结果A组32例,病死21例,生存11例,病死率65．62％;B组44例．病死15例,生存29例,病死率34．09％。A组和B组的病死率比较差异具有统计学意义（P〈0．005）。病程中各组病人根据食欲、进食情况,分为得“胃气”组（食欲、进食增加组）和失“胃气”组（食欲、进食无增加组）,前者病死率明显低于后者,差异具有统计学意义（P〈0．005）。治疗后B组消化道症状改善较A组明显,差异具有统计学意义（P〈0．005）。结论重症肺炎失“胃气”者（食欲差、进食少、营养补充不充分者）预后差．病死率高;而得“胃气”者（充分补充营养、治疗中食欲、进食增加者）抢救成功率高,病死率低。病程中出现食欲和进食增加者预后较好．印正了中医“得胃气者生”的理论,为重症肺炎患者重视营养支持和固护胃气的治疗提供理论依据。     

“雷公藤”治疗猪喘气病

遵照毛主席关于“中国医药学是一个伟大的宝库,应当努力发掘,加以提高”的教导,我所畜牧系在总结群众经验基础上,1972年开始了用草药“雷公藤”(香花崖豆藤 Millettia dielsiana)治疗猪喘气病的研究,现将其制备方法和治疗效果初步报告如下: 临床病例及治疗效果:对临床确诊为喘气病的78例进行了疗效试验。78例中,公猪35例,占45％,母猪43例,占55％;其中体重40斤以下的72例,体重80斤以上的6例。