表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

蚓激酶基因的人工合成及山羊乳腺表达

为了实现蚓激酶在真核细胞的高效稳定表达 ,人工合成了全长 849bp ,不含罕用密码子的蚓激酶F-Ⅲ-1cDNA序列 ,并以其为目的基因 ,构建以山羊β-酪蛋白启动子为上游调控序列的乳腺组织特异性表达载体pBLK和重组逆转录病毒表达载体pLN-bCP-LK。质粒pBLK 40 0 μg直接注入稳定泌乳期奶山羊乳腺 ,以纤维蛋白平板溶圈法 (FAPA)检测奶样纤溶活性。结果显示 ,注射后 3～ 60h ,奶样有明显纤溶活性 ,其中 6～ 9h活性最高。脂质体介导质粒pLN-bCP-LK转染PA317细胞系 ,5 0 0mg/LG418筛选后获得 4株高产毒细胞系 ,产毒滴度达 1× 1 0 ⁴～ 1× 1 0 ⁵CFU/ml水平。产毒细胞上清 1 0ml直接注入临产前两周的山羊乳腺 ,隔日以等量再注 1次 ,产羔后其奶样即有明显纤溶活性 ,注后第 45日纤溶活性仍无明显降低。     

山羊SREBP-1基因的超表达对脂肪酸代谢相关基因表达的影响

本研究旨在通过构建西农萨能羊固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)基因的重组腺病毒超表达载体,获得有感染性的病毒颗粒,并检测该基因过表达后对乳腺上皮细胞中脂肪酸代谢相关基因的影响,为进一步研究该基因在脂肪酸代谢及泌乳调控中的功能奠定基础。根据GenBank中收录的西农萨能羊SREBP-1基因的序列设计引物,PCR扩增后进行测序。将测序正确的目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后并进行线性化,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌Escherichia coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,将重组成功的质粒进行PacⅠ酶线性化,转染HEK 293细胞进行重组腺病毒的包装、扩繁及滴度测定。病毒液感染原代乳腺上皮细胞,实时荧光定量检测SREBP-1超表达效果及对脂肪酸代谢相关基因的影响。结果表明:重组腺病毒质粒构建成功,腺病毒滴度为109U/mL。病毒液感染乳腺上皮细胞48 h后,SREBP-1基因表达量上升大约15倍,72 h后,表达量上调了30倍;对脂肪酸代谢相关基因的影响在72 h较为明显,其中,脂肪酸合酶(FASN)及酰基辅酶A羧化酶(ACC)均显著上调了大约两倍,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)上调了大约1.5倍,肝素X受体(LXRα)及甘油三酯水解酶(ATGL)表达量升高了1.2倍;其中硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)表达水平无明显变化。表明在西农萨能羊乳腺上皮细胞中,SREBP-1能够促进脂肪酸合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂肪酸代谢具有调控作用。     

不同启动子对于牛催乳素表达的调控作用

在细胞水平上比较不同启动子对于牛催乳素(bPRL)表达的调控作用.分别构建了以CMV启动子、牛催乳素基因启动子和山羊β-酪蛋白基因启动子作为调控元件的bPRL真核细胞表达载体,分别命名为pCMV、pPRLP和pP1A3.将3种载体分别转染小鼠垂体瘤细胞和小鼠乳腺上皮细胞,使用RT-PCR和定量RT-PCR分析3种启动子启动bPRL在2种细胞系中的表达效果.pCMV在2种细胞中有效表达bPRL;pPRLP在2种细胞中的表达效果与pCMV接近:pP1A3不在垂体细胞中表达,在乳腺细胞中表达.pPlA3具有乳腺表达特异性;pPRLP能够在垂体和乳腺中高表达,在其他组织的表达特异性有待进一步研究.     

表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建

目的：构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法：将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒（HIV-1）的5′端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3／3′LTR、牛生长激素（BGH）基因poly（A）依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果：酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论：为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

禽网状内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能

通过PCR方法,将禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点(MCS)的EcoR I和Sac I之间,并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到SphI~HindIII之间,构建成重组质粒pUC-LTR。将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中,获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90。重组质粒经转染48h,能够检测到外源基因的表达。本研究提示,REVLTR能够作为启动子构建表达质粒。     

乳铁蛋白肽基因的合成及其在动物乳腺中的表达

根据已发表的编码牛乳铁蛋白肽(LfcinB)25个氨基酸的mRNA序列,设计了4条用于合成牛乳铁蛋白肽全基因的引物,用重叠延伸PCR法合成149 bp的牛乳铁蛋白肽基因(包括牛乳铁蛋白信号肽序列、上下游酶切位点和终止密码子),并将此基因克隆到载体pI-B,获得了乳腺特异性表达质粒pI-BL,该质粒经生理盐水稀释后直接注入稳定泌乳期奶山羊和奶牛乳腺组织(注射量为400μg),以琼脂板溶圈法检测奶样抑菌活性。结果显示,注射后3~48 h,奶样有明显抑菌活性,其中3~9 h抑菌活性最高。     

禽网状内皮组织增殖病病毒LTR序列的启动子功能

通过PCR方法,将禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)扩增并克隆进pUC-18质粒多克隆位点(MCS)的EcoR I和SacI之间,并以BGH基因的多聚腺苷酸序列作为终止子克隆到SphⅠ和Hind Ⅲ之间,构建成重组质粒pUC-LTR.将GFP基因和REV囊膜糖蛋白gp90基因分别克隆到pUC-LTR载体中,获得质粒pUC-LTR-GFP和质粒pUC-LTR-gp90.重组质粒经转染48h,能够检测到外源基因的表达.本研究提示,REV LTR能够作为启动子构建表达质粒.     

双价抗虫基因植物表达载体的构建

将蝎毒基因BmKITS和几丁质酶基因chitinase2个抗虫基因采用不同的启动子ubi或35S,连到2个高效的植物表达载体pWM101和pBI101中,2个重组表达质粒分别经过限制性酶切分析和PCR鉴定,实验结果表明2个含有双价抗虫基因的植物重组表达质粒均已构建成功．     

抗病毒基因MxA真核表达载体的构建及在鸡细胞中的表达

将人抗病毒蛋白基因MxA与携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒重组后构建MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经PCR和酶切方法鉴定后,重组质粒在脂质体介导下转染鸡成纤维细胞和睾丸组织原代细胞,通过荧光观察,RT-PCR及细胞免疫组化检测目的基因的表达.结果表明,MxA基因片段已经被克隆到pEGFP-C1表达载体,成功构建了MxA基因真核表达载体pEGFP-C1-MxA.经该重组质粒转染后的鸡细胞的胞质中呈现颗粒状分布的绿色荧光,RT-PCR扩增出EGFP和MxA基因的特异性片断,免疫组化结果显示EGFP报告基因在细胞内的阳性表达,并表现出MxA的表达特征,间接证明了MxA可在鸡细胞中表达.MxA基因真核表达载体的成功构建以及在鸡细胞中的表达为进一步研究MxA基因在抗禽病毒性疾病中的应用打下了基础.