应用TaqMan定量方法研究巴马香猪CYP1A1、2A19、2E1 mRNA表达

目的巴马香猪是我国具有特色和优势的实验用小型猪资源品系,用于药物评价具有广阔前景。方法 以β-actin作校正,利用TaqMan定量技术对巴马香猪肝、肾、肾上腺、小肠、皮肤、脑、肺、睾丸、前列腺、子宫和卵巢等组织中CYP1A1、2A19和2E1 mRNA的表达水平进行检测,检测结果与报道的人体对应酶CYP1A2、2A6、2E1进行比较。结果巴马香猪CYP1A1、2A19、2E1 mRNA均以肝脏中最高,肝外组织明显较低,并且巴马香猪肝脏CYP1A1、2A19、2E1 mRNA均低于报道的人肝对应酶。结论巴马香猪CYP1A1、2A19、2E1与人体对应酶CYP1A2、2A6、2E1的mRNA组织表达存在一定差异,提示在其作为相应CYP亚型代谢的药物评价时应考虑这种种属差异对实验结果推广到人的影响。     

实验用西藏小型猪CYP3A基因的克隆及序列分析

目的:克隆西藏小型猪CYP3A基因并与人及其它小型猪品种进行序列比对分析。方法:根据Genebank数据库设计引物,取西藏小型猪新鲜肝脏组织,Trizol法提取肝脏总RNA,应用RT-PCR反转获得肝脏cDNA。分别扩增基因CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39,PCR片段回收后分别连接pMD-18T载体,获得重组质粒pT-CYP3A,阳性重组克隆送测序。采用NCBI Blast及vector NTI软件进行序列比对分析。结果:CYP3A46、CYP3A22、CYP3A29及CYP3A39基因编码序列全长1512 bp,编码503个氨基酸,与人CYP3A4相同。其中CYP3A22和CYP3A39与NCBI记录巴马小型猪序列相同;CYP3A46与巴马小型猪CYP3A46(NM_001134824.1)有6个位点碱基不同。CYP3A29与巴马小型猪CYP3A46(EU918131.1)亦有6个位点碱基不同。对来自2个母本后代猪的基因经过PCR扩增后测序发现CYP3A46、CYP3A29序列完全一致。结论:成功克隆西藏小型猪CYP3A的4个基因,其中CYP3A46与人CYP3A4的序列相似性最高。所得CYP3A46与CYP3A29序列可能为西藏小型猪独有。     

小型猪CYP3A88基因克隆与其他动物的序列比较

目的克隆我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中的CYP3A88基因,并进行生物信息学分析。方法应用RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术对其全长进行扩增,测序,利用Internet和GenBank数据库对其序列进行生物信息学分析。结果首次克隆并鉴定了我国资源小型猪品系巴马香猪肝脏中CYP3A88（GenBank登录号：EF625347）的编码区,获得大小为1965bp的全长cDNA,编码区长为1512bp,编码503个氨基酸;比较核苷酸序列,与小型猪CYP3A39相似性高达94%,而与人等其它动物的CYP3A相似性则在86%以下;推导和分析氨基酸序列表明,与小型猪CYP3A其它成员（CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22）进行对比,其相似性分别为92%,89%,80%,而将小型猪与人的CYP3A分别比对,小型猪CYP3A88与人CYP3A4相似性最高,为77%;对其二级结构预测,它可能含12个α螺旋,4个β折叠;经NCBI上的CDD程序分析可知,其39～491氨基酸区域为P4503A亚家族保守结构区域;经聚类分析,小型猪和狗的CYP3A与人有较近的进化关系;通过同源建模法对其在线建模,人CYP3A4晶体结构作为其模建模型,得到了其经典的三维结构。结论在猪CYP3A家族四个基因中,CYP3A88在序列和高级结构上均与人CYP3A4的最为相似。     

巴马小型猪与贵州小型香猪遗传多样性的RAPD分析

应用经过筛选的31条引物对巴马小型猪和贵州小型香猪的基因组DNA进行RAPD扩增,分析二品系实验用小型猪的遗传多样性.两品系实验用小型猪品系内及品系间多态性位点的百分数分别为30.9%和25.7%,品系间及品系内的平均遗传距离分别为0.120、0.072和0.067.结果表明,两品系实验用小型猪品系间及品系内遗传多样性贫乏,遗传变异较小.     

贵州小型香猪和广西巴马小型猪微卫星位点的遗传学分析

利用35个微卫星位点对贵州小型香猪,广西巴马小型猪的封闭群进行了遗传检测,计算出两个小型猪品系个体样本微卫星位点的平均杂合度,多态信息含量（PIC）、有效等效基因数及品系间的遗传距离。结果表明两个品系的小型猪平均杂合度和PIC均较低,有效等效基因数与实测等位基因数较接近,也表明两品系均有稳定的遗传;两者的遗传距离表明贵州小型香猪和广西巴马小型猪亲缘关系较近,同时表明两者已分别成为两个猛增的封闭群动物。     

三种小型猪线粒体DNA控制区的比较研究

目的分析五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪线粒体DNA控制区碱基序列,比较研究不同猪种的遗传标志。方法应用PCR技术分别对这三种小型猪的血液总DNA样品中线粒体DNA D-loop区进行扩增,测序比对。结果猪的线粒体DNA D-loop区分三个区域。I区（靠近5’端区域）704bp,五指山小型猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点中归纳出3个单倍体,而巴马小型猪在此区有9个变异位点,通过9个变异位点归纳出4个单倍体,贵州香猪在此区共有6个变异位点,通过6个变异位点归纳出3个单倍体。Ⅱ区（串联重复序列区）,五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪序列相同。Ⅲ区（靠近3’端区域）三种小型猪的序列几乎相同。结论五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪三种小型猪之间线粒体DNA碱基序列变异位点较少,五指山小型猪和巴马小型猪亲缘关系较近。     

中国三种实验用小型猪mtDNA D-l00P多态性分析

分析中国三种实验用小型猪线粒体DNA(mtDNA)D-loop的多态性,建立各品种品系猪的遗传标记,为各品种品系猪的鉴别提供依据.应用PCR对西双版纳近交系小耳猪、广西巴马小型猪、贵州小型香猪和长白猪血液总DNA样品中mtDNA D-loop进行扩增,用23种限制性内切酶消化,观察其酶切多态.PCR扩增其mtDNA D-lcop 5′端227 bp高变区域,应用PCR-SSCP和PCR直接测序分析,观察其单链构象多态和序列多态.结果显示:3种小型猪之间未见酶切长度多态、单链构象多态和序列多态;与长白猪之间表现出单链构象多态和序列多态.本研究认为:3种实验用小型猪之间mtDNA多态性贫乏,证明其在母系起源和进化上的一致性,亲源关系很近,应用PCR-RFLP、PCR-SSCP和PCR直接测序分析,尚不能作为3种实验用小型猪品种品系鉴定的依据,但与长白猪等欧系猪比较有一定差异.     

西藏小型猪细胞色素b基因序列的比较

目的对西藏小型猪Cyt b-基因序列进行分析,研究其遗传背景及其与国内家猪的亲缘关系。方法提取西藏小型猪和巴马小型猪、贵州香猪、五指山猪的全基因组DNA,设计引物扩增Cyt b基因,测序后进行碱基序列比对,建立亲缘关系树,分析西藏小型猪的遗传背景。结果西藏小型猪等国内部分品种猪的Cyt b基因序列与欧洲猪相比有14个变异位点;但是西藏小型猪与国内品种猪相比存在两个特殊碱基位点即在420位点T→C转换的同时在883位点存在G→A转换。结论西藏小型猪与巴马小型猪、贵州香猪、五指山猪等国内家猪有很近的亲缘关系。同时进一步证实西藏小型猪群体内存在一定的遗传分化。     

地塞米松对从江香猪细胞色素氧化酶P450 3A29 mRNA表达的影响

从江香猪是全国稀有的微型猪种,其细胞色素氧化酶P450基因纯合度较高,遗传稳定,具备开发药物代谢动物模型的良好基础。本研究旨在应用实时荧光定量方法研究从江香猪细胞色素氧化酶P450 3A29 mRNA的组织分布及地塞米松对其表达的影响,并比较与人细胞色素氧化酶P450 3A4的相似性。结果表明,从江香猪细胞色素氧化酶P450 3A29 m RNA的组织分布特征及地塞米松对其诱导作用总体上与人体相似,从江香猪可用于人细胞色素氧化酶P450 3A4的诱导研究。     

三品系小型猪35个微卫星基因座的遗传学研究

利用35个微卫星基因座对中国三个品系的小型猪（贵州小型香猪、广西巴马小型猪、版纳小耳猪近交系）进行了遗传检测。计算出三个小型猪品系个体样本在35个微卫星基因座的纯合率,并对其进行t检验。计算出各品系的平均杂合度,多态信息含量（PIC）及品系间的遗传距离,并进行了系统聚类。结果表明三个品系的小型猪其基因纯合率均较高,其中版纳小耳猪近交系的基因纯合率最高;PIC和平均杂合度均较低;贵州小型香猪和广西巴马小型猪亲缘关系较近,并均与版纳小耳猪近交系的亲缘关系略远。 Abstract：The polymorphism of 35 microsatellites in the three miniature pig breeds in China(Guizhou miniature pig, Guangxi Bama miniature pig, Banna miniature pig inbred) was analysed. Rates of homozygote for 35 microsatellite loci in three miniature pig breeds were calculated,and t-test for them were performed. Mean heterozygosity and polymorphism information content(PIC) were calculated for all breeds, and genetic distances between these breeds were estimated. The dendrograms were obtained based on genetic distances. The results suggest that rates of homozygote in the three breeds are all high, and that is the highest in Banna miniature pig inbred. The results also suggest that polymorphism information content and mean heterozygosity in all the three breeds are low, and the genetic relationship between Guizhou miniature pig and Guangxi Bama miniature pig is closer than their relationship with Banna miniature pig inbred.     

五种品系猪亲缘关系的RAPD分析

应用190个RAPD引物对贵州小型猪,巴马小型猪、西双版纳近交系小耳猪JB和JS亚系、荣昌猪Ⅰ系、长白猪的亲缘关系进行了初步分析,其中39个引物的扩增结果具有非常明显的品系间多态性,将其扩增结果以RAPDistance package Version 1?04程序进行分析,计算相对遗传距离指数1－F,再用NJ法进行聚类分析,构建系统树。结果表明,三种小型猪相互间亲缘关系较近,尤以贵州小型猪与巴马小型猪更近。荣昌猪Ⅰ系和长白猪关系较近,但与小型猪关系较远。 关键词：随机扩增多态DNA;小型猪;亲缘关系 The phylogenetic relationship of five species of pigs including Guizhou miniature pig,Bama pig,Xisuangbanna inbred pig,Rongchang Pig and Landrance was studied by RAPD analysis.Thirty-nine single polymorphic primers were selected out of 190 primers.The amplified fragments of thirty-nine primers were analysed by the RAPDistance package version 1.04 and the phylogenetic tree was constructed using NJ method.The results indicated as the following: three strains of miniature pigs have close phylogenetic relationship and the phylogenetic relationship between Guizhou miniature pig and Bama miniature pig was much closer.Landrance and Rongchang pig have close phylogenetic relationship too,but their phylogenetic relationship is far from the three strains of miniature pigs.     

Characterization of hepatic drug-metabolizing activities of Bama miniature pigs (Sus scrofa domestica): comparison with human enzyme analogs

We used various substrates and selective inhibitors of human cytochrome P450 (CYP) isozymes as probes to study the metabolism of liver microsomes from Chinese Bama miniature pigs. Nifedipine oxidation (NOD) and testosterone 6beta-hydroxylation (6beta-OHT) activities were similar between human liver microsomes and those from Bama miniature pigs. However, compared with those from humans, liver microsomes from Bama miniature pigs showed decreased phenacetin O-deethylation, coumarin 7-hydroxylation, and chlorzoxazone 6-hydroxylation activities, whereas dextromethorphan O-demethylation activity was increased. Ketoconazole selectively inhibited NOD and 6beta-OHT activities in microsomes from Bama pigs, and 8-methoxypsoralen and tranylcypromine inhibited coumarin 7-hydroxylation in pig microsomes. However, furafylline and quinidine failed to selectively inhibit phenacetin O-deethylation and dextromethorphan O-demethylation in microsomes from Bama pigs, whereas chlormethiazole more efficiently inhibited coumarin 7-hydroxylation activity than chlorzoxazone 6-hydroxylation in pig microsomes. Our results suggest that liver microsomes from Chinese Bama miniature pigs are similar to those from humans in regard to metabolism of nifedipine and testosterone (both are probe substrates for human CYP3A4). In addition, chemical inhibitors used as specific probes for human P450 enzymes did not always show the same selectivity toward corresponding enzyme activities in liver microsomes from Bama pigs. However, ketoconazole (a potent inhibitor of human CYP3A4) could be used as a selective inhibitor probe for the NOD and 6beta-OHT activities in liver microsomes from Chinese Bama miniature pigs.     

在动物福利和“3R”原则的指导下建立贵州小型猪的实验方法

目的在动物福利及＂3R＂原则的指导下,建立贵州小型猪常用的实验方法。方法应用对动物刺激小、痛苦少的方法给贵州小型猪肌内注射、灌胃给药、采血、麻醉、静脉注射、处死给药等方法。结果建立了一套符合动物福利要求和＂3R＂原则的小型猪的实验方法。     

10个地方猪群体的系统聚类分析

利用微卫星标记技术分析了中国10个地方猪群体的亲缘关系。结果表明：不同的聚类方法导致的结果不同,根据Nei’s距离所得的NJ聚类结果与实际情况较为符合,它将10个地方猪群体分为3个类群：五指山小型猪、滇南小耳猪、贵州小型香猪及其近交系4个小型猪为一类群：沂蒙黑猪、汉中黑猪与荣昌猪为一个类群;二花脸猪、金华猪与巴马香猪近交系为一个类群。     

巴马小型猪肝硬化前后肠道乳杆菌的比较研究

目的比较巴马小型猪诱导型肝硬化造模前(正常猪)和造模成功后(肝硬化猪)肠道乳杆菌的变化情况,探讨小型猪肝硬化模型在肝硬化肠道微生态研究中的适用性。方法收集肝硬化造模前和CCl4诱导肝硬化造模成功后巴马小型猪的新鲜粪便,提取粪便总菌DNA,用乳杆菌特异性引物进行PCR扩增,对扩增产物进行变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel-Electrophoresis,DGGE),即用PCR-DGGE分析巴马小型猪肝硬化前后肠道乳杆菌的相似性和多样性。结果聚类分析和主成分分析显示巴马小型猪肝硬化前(正常猪)和肝硬化后混杂排列,无明显界限;多样性数据分析显示巴马小型猪肝硬化前后肠道乳杆菌的丰富度(S)、微生物区系Shannon-Wiener指数(H′)和均匀度(E)差异均无统计学意义(P0.05)。结论巴马小型猪肝硬化后肠道乳杆菌与正常猪比较差异无统计学意义。