红冬孢酵母苹果酸酶基因RKME1的克隆与表达

苹果酸酶(malic enzyme,ME)普遍存在于各种生物体中,在二价阳离子(Mg~(2+)或者Mn~(2+))的存在下,它可以催化L-苹果酸进行氧化脱羧反应,产生丙酮酸、CO_2和NADPH。前期分析结果预测红冬孢酵母YM25235菌株具有2个苹果酸酶同功酶基因RKME1和RKME2,而且RKME1基因在15℃低温条件下mRNA转录水平显著提高。为了验证RKME1的结构与功能,以红冬孢酵母YM25235 cDNA为模板,PCR扩增得到大小为1 623 bp的开放阅读框,共编码540个氨基酸。序列分析结果显示该序列含有苹果酸酶保守的4个结构域(Ⅰ~Ⅳ),同源建模结果显示该序列的三级结构和蛔虫中的苹果酸酶晶体结构有较高相似性且高度保守。进一步将RKME1插入到载体pET32a(+)中构建重组表达质粒pET32a-RKME1,然后导入大肠杆菌BL21中进行表达。经IPTG诱导,获得了相对分子质量约为70 kD的蛋白质条带。将该蛋白质进行镍柱亲和层析纯化后,酶活分析的结果表明,重组表达的RKME1蛋白可催化苹果酸脱氢生成丙酮酸,同时生成NADPH,酶活为160 U/mg以上。上述结果表明,RKME1是一个新的苹果酸酶基因,这为深入研究苹果酸酶与红冬孢酵母低温条件下生长适应性之间的关系奠定了基础。     

油桐种子脂肪酸延长代谢的转录表达与调控机理研究

油桐是我国四大木本油料植物之一,当前对油桐的研究主要集中在栽培选优及低产林改造方面,而对油桐脂肪酸延长代谢的分子机理研究尚未见报道。本研究以油桐果实膨大期、油脂转化初期和油脂转化高峰期的种子为材料,采用高通量RNA测序技术对油桐种子脂肪酸延长代谢的3个不同时期转录组进行比较,以nr、Swiss-Prot、KEGG和COG 4个蛋白数据库为参考,对油桐种子脂肪酸延长代谢进行了综合性分析。研究结果表明,参与油桐种子脂肪酸延长代谢途径的非冗余基因序列共37条,涉及的主要酶功能基因有9种;在果实膨大期、油脂转化初期和油脂转化高峰期中,调控脂肪酸延长代谢途径的基因存在明显的表达差异。综合分析结果绘制了油桐种子脂肪酸延长代谢途径,揭示了调控油桐种子脂肪酸延长代谢过程的基因作用规律。这些研究结果为油脂合成的遗传改良提供了资源和技术基础,同时为油桐分子设计育种提供了一定的科学依据。     

齿肋赤藓热激蛋白60基因的电子克隆和生物信息学分析

用电子克隆方法获得耐旱苔藓齿肋赤藓的热激蛋白60基因,采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、结构保守域、理化性质、信号肽、疏水性／亲水性、亚细胞定位、跨膜结构域、二级结构、功能域、活性位点、及同源性等方面进行了预测和分析。结果表明：齿肋赤藓热激蛋白60基因全长1841bp,开放阅读框1581bp,编码526个氨基酸残基;编码蛋白含有GroEL保守域,是chaperon-like superfamily家族;亚细胞定位分析显示,编码蛋白位于内质网中;活性化位点分析表明,编码蛋白存在6类活性位点;同源性分析表明,齿肋赤藓热激蛋白60与小立碗藓预测的HSP60同源性最高,达到92％,与卷柏的HSP60次之,同源性达88．83％。研究结果为该基因的实验克隆奠定基础。     

微粒体膜苹果酸酶活性与γ-亚麻酸含量的关系

用能生产不同GLA含量的油脂的被孢霉为试验材料,研究菌体所产油脂的GLA含量与菌体的微粒体膜结合的苹果酸酶活性之间的关系。结果表明,微粒体膜的苹果酸酶活性与菌体油脂的GLA含量存在显著的正相关关系,由苹果酸酶原位产生的NADPH是微粒体膜磷脂上脂酰基完成会饱和作用的关键所在,胞基质中的NADPH在脂肪酸的延长和去饱和中不能发挥作用。     

微粒体膜苹果酸酶活性与γ-亚麻酸含量的关系

用能生产不同GLA含量的油脂的被孢霉为试验材料,研究菌体所产油脂的GLA含量与菌体的微粒体膜结合的苹果酸酶活性之间的关系。结果表明,微粒体膜的苹果酸酶活性与菌体油脂的GLA含量存在显著的正相关关系,由苹果酸酶原位产生的NADPH是微粒体膜磷脂上脂酰基完成会饱和作用的关键所在,胞基质中的NADPH在脂肪酸的延长和去饱和中不能发挥作用。     

拟南芥未知功能基因At4g22890编码蛋白的叶绿体定位

蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察,GFP荧光仅在叶绿体中观察到,表明所克隆的DNA序列编码的多肽能够将At4g22890编码蛋白质引导进入叶绿体,由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。     

拟南芥未知功能基因At4g22890 编码蛋白的叶绿体定位

蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890 编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208 bp 的DNA 片段, 与绿色荧光蛋白(GFP) 基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP, 经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察, GFP 荧光仅在叶绿体中观察到, 表明所克隆的DNA 序列编码的多肽能够将At4g22890 编码蛋白质引导进入叶绿体, 由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。     

大豆E2泛素结合酶基因GmUBC1的克隆及在拟南芥中的异源表达

E2泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme)参与植物的抗逆、生长发育等多种生物途径的调控,其功能研究在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的报道较多,但在重要经济作物大豆(Glycine max)中鲜有报道。本研究从大豆"南农94-16"中克隆了1个与大豆子叶折叠突变体可能相关的基因Glyma.12G161200,序列分析结果表明该基因编码一个E2泛素结合酶,因此将其命名为GmUBC1。该基因编码区全长为462 bp,编码一个含153个氨基酸的蛋白,预测其分子量为17.25 kDa,等电点为6.74。利用qRT-PCR技术对GmUBC1在大豆不同组织中的表达模式及其对不同非生物胁迫和激素处理的响应模式进行分析,发现该基因在开花后40d种子中表达量最高,在PEG、低温、JA和ABA处理下表达下调。亚细胞定位分析发现GmUBC1蛋白在整个细胞内都有表达。进一步在拟南芥中异源表达GmUBC1,发现转基因株系的千粒重和总氨基酸含量显著提高,表明异源过表达GmUBC1可以调控种子重量和氨基酸含量,为大豆品质改良提供了基因资源。     

大豆PM34基因生物信息学预测及表达分析

以大豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR法从吉豆2号品种中克隆获得大豆种子成熟蛋白( PM34)基因序列,利用生物信息学方法对大豆PM34基因编码的蛋白进行预测。结果表明：该基因编码蛋白理论分子量为31.7 kDa,等电点为6.60,为亲水性蛋白;该蛋白中无跨膜结构;该蛋白中不存在信号肽。 PM34基因编码蛋白的二级结构中α螺旋占12.97％,无规则卷曲占41.30％,β折叠占45.73％。 PM34基因编码蛋白的三级结构预测表明,同源模建的模板是3ijr.1.A,是一种短链脱氢酶/还原酶,与该蛋白的同源性为54.65％。在进化关系上,与绿豆、苜蓿的亲缘关系相对较近。采用实时定量PCR方法( qRT-PCR),检测大豆PM34基因在大豆各器官中的表达方式,结果表明该基因在大豆根、茎、叶、花中的表达活性低,而在种子中,尤其是成熟种子中的相对表达活性很高。该研究结果为大豆PM34基因结构和功能的进一步研究奠定了基础。     

紫苏PfLEC1基因的克隆及表达研究

紫苏是目前发现的α-亚麻酸含量最高的药食同源经济作物,其种子油脂中含60%以上的α-亚麻酸。该研究基于紫苏转录组测序结果,从紫苏种子中克隆获得植物种胚发生过程中的关键基因Leafy Cotyledon 1(Pf LEC1),并对其进行相关生物信息学分析、实时荧光定量PCR以及不同时期种子的脂肪酸含量测定,以探讨紫苏α-亚麻酸高效合成积累的分子调控机制。(1)序列分析结果表明,Pf LEC1基因编码区长度为621 bp,可编码206个氨基酸,属于NF-YB亚基家族,含有HAP3亚基的保守功能域B区域;在线预测该蛋白为不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域,定位于细胞质;进化分析表明,该蛋白序列与拟南芥、甘蓝型油菜、水稻和玉米关系较近。(2)实时荧光定量PCR分析表明,PfLEC1基因在紫苏根、茎、叶、花及种子中均有表达,且在种子中表达量最高,根中表达最低;PfLEC1在种子发育的前期表达较高,随着种子发育表达量显著下降。(3)不同阶段紫苏种子脂肪酸含量分析表明,油酸、α-亚麻酸含量随种子发育逐渐增加,而棕榈酸、硬脂酸、亚油酸含量变化则相反,其中变化最为明显的是α-亚麻酸,从种子发育5 d时的33.16%上升至20 d时的65.16%,表明紫苏种子中α-亚麻酸含量是随种子发育快速积累的。研究推测,PfLEC1可能与紫苏种子α-亚麻酸的高含量合成积累密切相关,该研究为今后深入探讨PfLEC1基因的功能奠定了分子基础。     

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。     

HSV—1感染人成纤维细胞中HTRP基因的生物信息学分析

依靠生物信息技术对HSV I型病毒刺激KMB－17细胞后克隆得到的差异基因HTRP和其编码蛋白序列的特征进行了分析和预测,初步推测了该基因的转录调控序列和编码蛋白的结构特点,为深入研究病毒刺激后细胞基因表达所编码序列的功能提供了基本数据。     

棉花抗逆基因GhAREB4的克隆及功能分析

AREBs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应,在植物抵御各种逆境胁迫中起着非常重要的作用。该研究经序列电子拼接克隆了陆地棉GhAREB4基因,该基因全长1 784bp,其开放阅读框为1 227bp,编码408个氨基酸,预测分子量为44.3kD,等电点为8.88。蛋白结构预测发现,该蛋白二级结构中含有bZIP基因家族的保守结构域。系统进化树分析表明,GhAREB4与可可的AREB转录因子同源性最高。绿色荧光蛋白亚细胞定位分析表明,GhAREB4蛋白分布在细胞核内。qRT-PCR分析表明,GhAREB4基因在花中的表达量最高;且GhAREB4基因表达受到干旱、高盐、低温、脱落酸(ABA)等处理的诱导,其可能调控棉花对非生物逆境的耐性响应。研究结果为进一步研究该基因对棉花耐逆调控机制奠定了基础。     

灯盏花chi的克隆及其生物信息学分析

查尔酮异构酶(CHI)是调控黄酮生物合成的关键酶,分离和克隆这一酶的功能基因,对利用转基因技术进行灯盏花黄酮生物合成的调控具有重要意义。本研究采用RT-PCR和RACE技术,获得了chi cDNA全序列,GenBank登录号为GU208823.1,序列全长996 bp,开放阅读框为594 bp,编码197个氨基酸,3-Race有一个多聚腺苷酸加尾信号。应用软件预测该基因编码蛋白分子量约为21.6 kD,理论等电点为4.78。该基因编码的蛋白无跨膜结构域,其二级结构的主要构件为α-螺旋和随机卷曲。对其三级结构进行了建模,表明其结构与苜蓿chi的三级结构相似。同时根据灯盏花chi N端序列变化的特征,提出了灯盏乙素的合成可能与chi在细胞亚结构的定位及其与合成代谢相关酶形成复合酶的特异性有关。研究为利用基因工程定向改变灯盏花黄酮代谢产物奠定了基础。     

檀香SaRbohA基因的克隆与吸器诱导因子响应分析

植物Rboh基因家族编码产生活性氧(ROS)的NADPH氧化酶。了解半寄生植物檀香(Santalum album Linn.)基因Rboh相关信息和表达特性,可为研究檀香SaRbohA基因通过活性氧信号(ROS)调控吸器发育的响应提供理论依据。该研究以全长转录组测序为基础,通过序列拼接设计合成基因特异引物,从根中克隆获得了1个檀香respiratory burst oxidase homolog(Rboh)基因cDNA全长,命名为SaRbohA。序列分析表明,该基因cDNA全长2 790 bp,编码929个氨基酸,分子量105.37 kD,理论等电点9.13,预测亚细胞定位于细胞膜。结构预测表明,SaRbohA具有6个跨膜结构域,在膜内侧的C端包含典型的NADPH结合结构域和FAD结合结构域, N端含有两个EF手性结构。序列比对分析表明,檀香SaRbohA与苹果MdRboh同源进化关系较近,相似度为63.65%。组织特异性表达分析表明,SaRbohA基因在茎中表达量最低,幼叶和茎尖中表达量较高,而在根中表达量最高。采用2, 6-二甲氧基对苯醌(寄生植物吸器诱导因子)处理,可以强烈诱导檀香SaRbohA基因的响应并伴随大量活性氧信号。研究推测,SaRbohA基因的在ROS信号介导的檀香吸器发育过程中起重要作用,且受化学诱导因子调控表达。     

三穗麻鸭MT基因克隆与序列分析

目的:为三穗麻鸭金属硫蛋白(MT)的结构与功能研究提供基础材料。方法:应用MT特异引物,通过RT-PCR从三穗麻鸭肝组织总RNA中扩增目的基因,克隆测序后应用生物信息学软件对该编码蛋白二级结构、亚细胞定位、跨膜结构及信号肽进行预测。结果:三穗麻鸭MT基因全长185bp,可编码61个氨基酸,其中半胱氨酸19个,丝氨酸9个,不含芳香族氨基酸;该基因序列与绿头鸭MT基因的核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性达100%;该蛋白为可溶性蛋白,可分布细胞核内和核外,不含信号肽。结论:首次克隆出三穗麻鸭金属硫蛋白基因。     

油菜蔗糖转化酶基因的电子克隆和生物信息学分析

运用电子克隆技术获得油菜中一个蔗糖转化酶基因eDNA序列,同时根据此段序列设计引物以油菜eDNA为模板进行扩增。经测序得到证实。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、跨膜结构域、信号肽导肽、疏水性／亲水性、二级结构、亚细胞定位等方面进行了预测和分析。结果表明：该基因eDNA序列长度为2150bp,包含一个1779bp开放阅读框,编码592个氨基酸;该编码蛋白含有蔗糖转化酶的多个典型的保守结构域。同源比对分析显示,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥等植物的蔗糖转化酶基因具有高度的相似性,进一步确定该蛋白为蔗糖蛋白酶。研究结果为该基因进一步的实验克隆,表达分析,功能鉴定奠定基础。     

灯盏花 chi 的克隆及其生物信息学分析

查尔酮异构酶（CHI）是调控黄酮生物合成的关键酶,分离和克隆这一酶的功能基因,对利用转基因技术进行灯盏花黄酮生物合成的调控具有重要意义。本研究采用RT-PCR和RACE技术,获得了chi cDNA全序列,GenBank登录号为GU208823.1,序列全长996 bp,开放阅读框为594 bp,编码197个氨基酸,3-Race有一个多聚腺苷酸加尾信号。应用软件预测该基因编码蛋白分子量约为21.6 kD,理论等电点为4.78。该基因编码的蛋白无跨膜结构域,其二级结构的主要构件为α-螺旋和随机卷曲。对其三级结构进行了建模,表明其结构与苜蓿chi的三级结构相似。同时根据灯盏花chi N端序列变化的特征,提出了灯盏乙素的合成可能与chi在细胞亚结构的定位及其与合成代谢相关酶形成复合酶的特异性有关。研究为利用基因工程定向改变灯盏花黄酮代谢产物奠定了基础。     

固醇调节元件结合蛋白与脂质代谢

固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins,SREBPs)是脊椎动物细胞脂质稳态的转录调节物,可直接激活多个参与胆固醇、脂肪酸、甘油三酯、磷脂合成和摄取,以及辅助因子NADPH等基因的表达,从而调控胆固醇及脂肪酸等脂类的代谢过程。本文综述了SREBPs转运和活化的过程,以及调节细胞脂质稳态功能的分子机制,并探讨了其在脂代谢紊乱相关疾病发生中的重要作用。     

家蚕细胞凋亡相关基因BmICAD的克隆、序列和功能分析及其在精巢中特异表达的初步研究

DREP-1基因在果蝇的细胞凋亡过程中对DNA的降解有重要调控作用。本研究将该基因序 列在家蚕EST数据库中进行同源性检索,把检索到的EST序列进行电子延伸和克隆重叠群拼接,根据拼接结果设计引物进行PCR扩增并克隆测序验证,首次成功克隆了家蚕第一个ICAD基因BmICAD的cDNA： 该cDNA全长844 bp,ORF长522 bp, 编码含有174个氨基酸的蛋白;预测分子量为19.6kD,等电点为4.23,所编码蛋白与果蝇DREP-1的一致性(identity)为36%;虽然Northern印记杂交未检测到信号,但是RT-PCR结果显示,该基因在精巢中特异表达。