表达重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的大肠杆菌工程菌的高密度培养

采用溶氧反馈的分批培养流加补料的方法高密度培养重组大肠杆菌BL21(DE3)生产重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。通过摇瓶培养对菌种和培养条件的初步筛选,采用溶氧反馈的流加补料策略,进行了5L发酵罐的合成培养基和复合培养基的发酵工艺的研究。通过对培养条件的不断优化,重组葡激酶-水蛭素融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)里得到了高效表达,菌体密度最终达到115g/L(WCW)以上,可溶性重组融合蛋白占菌体总蛋白的30%以上,含量约为1.1~1.2g/L。5L发酵罐的发酵工艺参数在40L发酵罐中进行了放大培养,结果表明该工艺能有效的放大,可适用于工业生产。     

人组织型纤溶酶原激活剂-水蛭素融合基因的构建及其在毕赤酵母中的表达

构建并表达兼有溶栓和抗凝活性、减少出血副作用的人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和水蛭素(HV2)的融合蛋白。通过提取总RNA和RT-PCR获得t-PA基因,与HV2基因通过活化凝血因子X(Fxa)识别序列（IEGR）的对应碱基序列连接构成融合蛋白基因,融合蛋白基因经pGEM-T、pIC9克隆至表达载体pIC9K上,电转导入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115。转化子摇瓶内甲醇诱导表达。纤维蛋白平板溶圈法和纤维蛋白凝块法分别检测溶栓和抗凝活性。琼脂糖凝胶电泳结果显示克隆的t-PA基因片段大小为1700bp,序列测定结果表明其35位氨基酸由文献报道的精氨酸突变为色氨酸。限制性酶切和PCR鉴定结果均表明融合蛋白基因已克隆入表达载体和宿主菌。甲醇利用实验、G418抗性筛选获得多拷贝甲醇利用快型克隆。甲醇诱导表达产物具有纤溶活性并可被抗t-PA抗体抑制。完整融合蛋白无抗凝活性,但以Fxa裂解后可释放抗凝活性。同时,融合蛋白以单链和双链两种形式存在。融合蛋白在血栓部位特有的Fxa作用下靶向释放抗凝活性,具有溶栓抗凝双功能,有望降低临床出血副作用。     

新型水蛭素嵌合抗栓剂的构建表达与功能研究

水蛭素（Hirudin,HV）作为新一代抗凝剂,它是目前已知最强的天然凝血酶抑制剂,并有望在临床上完全取代肝素。虽然水蛭素有许多优点,但出血倾向是其在临床应用上的主要副作用。目前尚没有好的解决办法。针对水蛭素在临床应用中所出现的这个问题,依据血栓形成的生理生化机制,构建出了含FXa识别序列水蛭素嵌合抗栓剂,来降低水蛭素在非血栓部位的活性从而减小出血的危险。小鼠尾部血栓模型实验表明：此新型嵌合抗栓剂能在不减少水蛭素抗凝血活性的同时,又能大幅度地降低出血副作用。具有非常重要的临床意义。