玉米耐渍功能基因组分析及相关基因Sicyp51的鉴定与克隆

选用耐渍性有明显差异的玉米自交系Mo17和Hz32, 对二叶一心期的幼苗进行淹水处理, 构建了这两个材料各自正向和反向的SSH(suppression subtractive hybridization)文库. 从SSH文库中筛选到105个阳性克隆; 利用处理及对照mRNA与Mo17全生育期cDNA芯片分别杂交, 得到57个3倍以上表达差异的克隆. 对所有162个克隆进行序列分析, 结果表明: 所有差异表达的克隆代表85个TUGs(tentative unique genes), 这些TUGs主要参与厌氧代谢、逆境自我保护、信号传导、细胞结构和能量代谢等生理生化途径, 同时还包括41个未知功能的cDNA, 说明玉米根系对淹水胁迫响应涉及到复杂的代谢反应. 对从Mo17和Hz32中筛选到的差异表达克隆进行比较分析发现, 在淹水条件下, 耐渍性不同的材料具有不同的耐渍相关基因的表达模式. 利用Northern及RT-PCR检测了部分阳性克隆的表达谱, 并克隆到一个与耐渍相关的新基因(Sicyp51).     

玉米MCM2基因的克隆与功能验证北大核心CSCD

内复制是影响玉米胚乳发育的关键因素。通过降低CDK(周期蛋白依赖性激酶)活性,胚乳细胞可实现有丝分裂向内复制转变,进而推动籽粒快速灌浆。该研究以玉米微染色体维持蛋白ZmMCM基因家族为对象,对其基本生物信息学特征和非生物胁迫条件下的表达特征进行系统分析,并对其中低温胁迫响应明显的ZmMCM2通过转基因和酵母双杂的方法进行功能验证和分子互作分析。结果表明:(1)在玉米基因组中共鉴定到17个MCM家族成员,分布于6条染色体,而且部分基因间存在串联重复基因和片段复制基因;不同物种MCM蛋白的系统进化树可分为6个亚组,玉米、水稻和拟南芥的MCM2蛋白同属于第Ⅳ亚组;启动子序列分析显示,MCM家族基因启动子序列含有许多与激素响应、胁迫应答以及生长发育调节相关的顺式作用元件。(2)逆境胁迫响应分析表明,MCM基因表达受到NaCl和ABA抑制,对PEG、高温以及低温表现出不同程度的应答,尤其对低温具有明显响应。(3)ZmMCM2基因的过表达会对内复制产生一定的抑制作用,进而导致拟南芥植株矮小、莲座叶数减少以及种子体积缩小。(4)亚细胞定位结果显示,ZmMCM2基因定位于细胞核内;cDNA文库筛选和回转验证发现,MCM2与CDC73相互作用。该研究结果为进一步深入了解MCM2蛋白的分子作用机理奠定了基础。     

口蹄疫病毒三价复合多表位佐剂DNA疫苗构建及其免疫原性

以O型、A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,以来源于非结构蛋白3ABC和结构蛋白VP4上的3个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建了O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,在此基础上,以金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)为基因佐剂,通过分子设计构建了SEA与OAAT融合表达基因。将构建好的表达盒OAAT与SEA融合表达基因克隆至真核表达载体PVAX1PCMV启动子下游,构建了口蹄疫三价基因佐剂DNA疫苗pEA。经Western blotting和IFA检测,目的蛋白在Hela细胞中获得正确表达。小鼠免疫实验表明,pA和pEA免疫组的血清抗体均能分别与O型、A型和AsiaI抗原反应,与对照组相比差异较显著,且pEA免疫组和灭活疫苗免疫组抗体水平均显著高于pA免疫组;同时pA和pEA免疫小鼠细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10较对照组显著提高,且pEA免疫组的IL-2、IFN-γ和IL-4水平明显高于pA免疫组。用O/NY00和Asia1/YNBS/58株FMDV进行...     

牛病毒性腹泻病毒Erns-E2融合蛋白在果蝇S2细胞中的表达与鉴定

目的:利用果蝇S2细胞表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns-E2融合蛋白,并对其抗体结合能力进行鉴定.方法:用RT-PCR方法扩增BVDV NADL株Erns和E2蛋白的编码基因,利用(G4-S)3柔性15肽基因将扩增的2个基因连接,再与昆虫表达载体pMT/BiP/V5-His连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5-His-E(MS)-E2,将后者与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞后表达Erns-E2融合蛋白.并对表达产物进行鉴定.结果:SDS-PAGE结果表明,融合蛋白相对分子质量为76 800;Westem blotting检测表明,该融合蛋白具有与BVDV抗体良好的结合能力.结论:BVDV的Erns-E2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行表达;经鉴定,表达产物具有良好的抗体结合能力,可用于抗原检测.     

干旱高温复合胁迫下sHSPs基因在不同耐旱性玉米中的表达差异及其对ABA和H2O2的响应

以4个玉米(Zea mays L.)品种——‘郑单958’(耐干旱)、‘浚单20’(耐高温)、‘隆玉602’(耐干旱高温复合胁迫)和‘驻玉309’(对3种胁迫均敏感)为实验材料,分别采用脱落酸(ABA)及其抑制剂氟定酮(F)、H2O2及其清除剂碘化钾(I)和丙酮酸钠(P)预处理,探讨干旱高温复合胁迫下小热休克蛋白(sHSPs)在不同耐旱性玉米品种中的表达以及ABA和H2O2对其表达的影响。结果显示:(1)高温、干旱高温复合胁迫诱导的sHSP16.9、sHSP17.2、sHSP17.4、sHSP17.5、sHSP22和sHSP26等6个sHSPs基因表达增加量明显高于干旱和对照。(2)在6个sHSPs中,sHSP17.2基因仅在‘郑单958’中表达;sHSP16.9、sHSP17.4和sHSP26基因在‘隆玉602’中表达增加量最高,在‘驻玉309’中表达增量最低;sHSP17.5和sHSP22基因在‘郑单958’中表达增加量最高,在‘驻玉309’中最低。(3)ABA、F、I和P预处理后,对干旱高温复合胁迫诱导的6个sHSPs基因表达增加量仅有略微影响,但显著影响了sHSP26的蛋白表达。研究表明,sHSPs在不同耐旱性玉米品种中的表达存在显著差异,ABA和H2O2仅稍微提高了sHSPs基因表达,但显著提高了sHSP26蛋白表达,这些结果为进一步研究植物在多胁迫条件下耐逆机理奠定了基础。     

基于肝癌CDK2 基因敲减对CyclinE 表达及树舌多糖GF对其影响的研究

目的:探究树舌多糖GF(GAPS.GF)对rAAV-shRNA-CDK2抑制肝癌细胞Cyclin E基因表达的辅助作用。方法:将细胞培养后的人肝癌HepG2以皮下注射的方式接种于裸鼠前肢腋下,接种后的裸鼠随机分为5组:NC(非相关序列)对照组、肿瘤组、rAAV-shRNA-CDK2组、树舌多糖GF组以及树舌多糖GF+rAAV-shRNA-CDK2组,各实验组均采取尾静脉注射定量给药。采用实时定量PCR和Western blot技术研究肝癌细胞Cyclin E基因m RNA和蛋白水平的表达情况,同时观察GASP.GF对其作用的影响。结果:树舌多糖GF+rAAV-shRNA-CDK2联合应用组对肝癌HepG2细胞增殖的抑瘤率为75.6%,对Cyclin E基因mRNA表达抑制率为69%,对Cyclin E基因蛋白表达抑制率为67.5%,比rAAV-shRNA-CDK2组分别提高了3.42%、1%和2.7%。结论:树舌多糖GF与rAAV-shRNA-CDK2联合应用可以显著提高肝癌的治疗效果,说明树舌多糖GF可以辅助r AAV-shRNACDK2对肝癌细胞Cyclin E基因的表达的抑制作用。     

萝卜硫素诱导RASD1的表达促进宫颈癌HELA细胞凋亡及周期阻滞的机制研究

目的:探讨萝卜硫素靶向RASD1,对宫颈癌细胞(HELA)凋亡及周期的影响机制。方法:不同浓度的萝卜硫素(SFN)作用于HELA细胞48h,采用CCK-8法检测SFN对HELA细胞增殖的影响;采用RT-PCR法检测SFN对RASD1基因mRNA表达水平的影响;采用Western印迹法检测SFN对RASD1蛋白表达水平的影响;采用流式细胞技术检测加药以及过表达RASD1对HELA细胞凋亡及周期的影响,采用Western blot检测HELA中cleaved-caspase3和cleaved-parp相关凋亡蛋白以及p21和cdc2周期相关蛋白的影响。结果:SFN抑制宫颈癌细胞增殖,且加药组中RASD1的mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。流式细胞凋亡分析结果提示:加SFN或是过表达RASD1细胞组凋亡率明显高于对照组,Western blot结果表明加SFN或过表达RASD1后细胞cleaved-caspase3以及cleaved-parp蛋白水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);ModFit LT软件分析结果表明加SFN或过表达RASD1细胞S期显著低于对照组,G2/M期细胞增多,同时Western blot结果示p21蛋白的表达水平增高,而cdc2蛋白表达降低,其差异有统计学意义(P0.05)。结论:在宫颈癌HELA细胞中RASD1作为SFN的作用靶点,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。     

杂交稻亲本核糖体DNA的ITS序列比较

以典型粳稻(O．sativa ssp．japonicn)秋光作为外类群,典型籼稻(O．sativa ssp．indica)南京11号作为对照,对两优培9、培两优288、汕优63三个籼型组合的6个亲本的核糖体基因(nrDNA)内转录间隔区(ITS)的全序列进行了比较分析,结果表明：供试材料的ITS序列有较丰富的遗传差异,以ITS序列信息构建的系统树能反映出品种间的亲缘关系,3个组合亲本间遗传距离以超级稻两优培九的亲本9311与培矮64S遗传距离最远．     

稳定表达Aβ特异性单链抗体的哺乳动物细胞株构建和功能研究

构建可以稳定表达Aβ特异性单链抗体(scFv)的哺乳动物细胞株。应用重叠延伸PCR的方法,以前期建立的Aβ特异性单克隆抗体(A8)的轻、重链可变区基因为模板,构建scFv的基因片段,通过(G_4S)_3或p2A两种不同的连接肽(Linker)序列,拼接得到多种形式的scFv基因片段,用于构建真核表达载体。利用脂质体分别转染人宫颈癌细胞(Hela)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO),Western blot鉴定scFv的表达情况;以潮霉素筛选获得稳定表达抗Aβ的scFv细胞株,以间接ELISA和斑点印迹分析所得scFv的抗原识别能力;采用体外细胞实验,在超微病理水平分析所得scFv的细胞保护作用。结果:成功构建了Aβ特异性scFv的3个真核表达载体pSecTag2/HygroA-VL-(G_4S)_3-VH、pSecTag2/HygroA-VH-(G_4S)_3-VL和pSecTag2/HygroA-VL-p2A-VH,获得了2株稳定表达Aβ特异性scFv的细胞株Hela-VL-p2A-VH和CHO-VL-(G_4S)_3-VH。Western blot结果表明了相应scFv的正确表达,间接ELISA和斑点印迹结果表明所分泌的细胞上清具有Aβ抗原识别能力,体外实验显示其具有阻断和抑制Aβ寡聚体细胞毒性的作用。稳定表达Aβ特异性单链抗体的细胞株有助于AD免疫治疗基础研究的进一步开展。     

乙型肝炎病毒PreS2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。     

Functional genomics of maize submergence tolerance and cloning of the related gene <Emphasis Type="Italic">Sicyp51</Emphasis>

In this study, SSH (Suppression Subtractive Hybridization) and cDNA microarray were used to identify genes associated with waterlogging response of maize roots. Mo17 and Hz32 are two maize inbred lines with differential tolerance to hypoxia. Seedlings of the inbred lines with two leaves were submerged in hypoxia buffer. SSH libraries were constructed with cDNA samples from roots. Both forward and reverse subtractions were performed for each inbred line, and 105 positive clones induced by hypoxia were selected by differential screening. The treated and control message RNA were hybridized with the cDNA microarray of Mo17, sequentially, 57 of 3-fold differentially expressed clones were obtained. A total of 162 positive clones were all sequenced. Bioinformatics analysis showed these positive clones represent 85 TUGs, including genes involved in several biochemistry pathways, such as glycolysis, protection, signal transduction, cell construction and energy metabolism and 41 EST with unknown function. Comparison between Mo17 and Hz32 indicates that genes related to hypoxia tolerance have different expression patterns in submerged roots. Several positive clones' expression patterns were revealed by Northern or RT-PCR, and a new gene (Sicyp51), which may contribute to hypoxia tolerance, was identified.     

Functional genomics of maize submergence tolerance and cloning of the related gene Sicyp51

In the middle and lower Yangtze River area, the major corn-growing region of South China, seasonal rainfall greatly affects maize plantation. Maize seed-lings meet with excessive precipitation and low tem-perature in spring, and when they grow up to begin flowering, they usually encounter Mei-yu storm ac-companied by hot days. At the same time, bad irriga-tion system and a higher level of underground water cause waterlogging, which further leads to yield losses. In order to reveal the molecu…     

玉米赖氨酸相关基因opaque-2及其修饰基因研究进展

玉米隐性突变o2基因能通过减少醇溶蛋白的合成来显著提高赖氨酸含量,为培育高赖氨酸含量的优质蛋白玉米（quality protein maize, QPM）提供了良好的基因资源。对玉米o2基因的发现、研究现状及其修饰基因的研究进展,以及当前育种家利用这两种基因相互作用培育优质蛋白玉米的研究进展进行了综述,以期为高赖氨酸玉米育种提供参考。     

Kernel lysine content does not increase in some maize opaque2 mutants

The recessive mutant allele of the opaque2 gene (o2) alters the endosperm protein pattern and increases the kernel lysine content of maize (Zea mays L.). In this study, sequencing results showed that the o2 mutant was successfully introgressed into 12 elite normal maize inbred lines by marker assisted selection (MAS). The average genetic similarity between these normal inbred lines and their o2 near-isogenic lines (NILs) was more than 95%. Kernel lysine content increased significantly in most of o2 NILs lines relative to normal elite inbreds, but remained unchanged in the genetic backgrounds Dan598o2 and Liao2345o2. Moreover, the kernel characteristics of these two o2 NILs did not differ from the other inbred lines. The results of lysine content analysis in the F1 hybrids between Liao2345o2 and Dan598o2 and other o2 NILs demonstrated that gene(s) other than opaque2 may control kernel lysine content in these two o2 NILs. The results of zein analysis showed that 22-kD α-zein synthesis was reduced or absent, and the 19-kD α-zein synthesis was greatly reduced compared with the recurrent parents in most o2 NILs except for Dan598o2 and Liao2345o2. Our results indicate that gene(s) other than opaque2 may play more important roles in zein synthesis and kernel lysine content in some maize genetic backgrounds.