犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白（CPVVP2）,用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母（Pichiapastoris）分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA—VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPVVP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPVVP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64．35kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPVVP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

目的通过构建毕赤酵母表达载体将香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中进行表达,同时对表达产物进行鉴定。方法从香菇菌C91-3菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3＇-Full RACE、5＇-Full RACE方法获得24414基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K中,构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414。用电转化的方法将此质粒转化到毕赤酵母GS115中并进行诱导表达,对表达产物用Westen-blot方法进行鉴定。结果通过菌落PCR和基因序列分析确定插入pPIC9K中的片段为24414基因片段,通过Westen-blot方法确定所表达蛋白为目的蛋白。结论重组质粒pPIC9K-24414成功构建,目的凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功表达,为进一步研究香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414的生物学功能奠定了基础。     

辣根过氧化物酶同工酶C基因在巴斯德毕赤酵母中的克隆与鉴定

目的：克隆辣根过氧化物酶同工酶C基因,为此基因的表达作准备。方法：用PCR方法从辣根的总DNA中扩增得到一种辣根过氧化物酶同工酶C基因HRPC2,通过PCR的方法去除内含子后连接到pMD18-T载体上,测序证明正确后,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒pC2EX9K。再将辣根过氧化物酶同工酶C基因在毕赤酵母中进行克隆、鉴定。结果：重组质粒pC2EX9K转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论：应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HRPC2。     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

钝顶螺旋藻sod基因真核表达载体的构建与表达

目的:在毕赤酵母中表达钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶SOD。方法:以质粒p ET30-sod为模板,采用PCR扩增sod基因,并将其与表达载体p PIC9K相连,构建重组表达质粒p PIC9K-sod。将重组质粒p PIC9K-sod用限制性内切酶PmeⅠ线性化,并电转化入毕赤酵母GS115。利用单菌落PCR筛选整合有重组质粒的阳性转化子,用甲醇进行诱导表达,并在5L发酵罐内进行发酵表达目的蛋白。用改进的邻苯三酚自氧化法测定重组SOD的活性。结果:成功构建了钝顶螺旋藻的sod的真核表达载体,并在毕赤酵母中表达了分子量为22k Da的重组蛋白SOD。发酵罐高密度发酵所获目的蛋白的平均浓度为0.36±0.4 mg/m L,比活性为409±17U/mg。结论:在毕赤酵母中表达了分子量为22k Da的钝顶螺旋藻SOD。     

乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型.有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点.然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal I线性化的pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德-毕赤酵母GS115His-中.通过MD-G418平板筛选和5'AOX1和3'AOX1引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut+酵母工程菌株.此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS-PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应.     

牛凝乳酶基因在毕赤酵母中的重组表达

通过PCR技术从克隆载体pMD18T-Prochy上扩增牛凝乳酶原基因,双酶切后定向插入到酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-Prochy,线性化后电转化毕赤酵母GS115,经PCR和测序鉴定凝乳酶原基因成功插入到毕赤酵母的基因组中。在甲醇诱导下进行凝乳酶的表达,SDS-PAGE分析证明重组凝乳酶的分子量约为37 kD,培养基上清液中凝乳酶的活性为12.2 SU/mL。本研究首次应用毕赤酵母表达牛凝乳酶,在培养基中获得分泌表达的重组凝乳酶,为干酪工业提供了新型及优良的凝乳酶来源。     

HBV PreS2＋S／INF—α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBV PreS2 S和INF-α融合基因的真核表达载体HBV PreS2 S/INF-α并在真核细胞中进行表达,应用重叠延伸剪切技术（splicing by overlapping extension,简称SOE）经两次PCR获得嵌合基因片段S2S／IFN－α,回收后直接克隆到pcDNA3.1 V5/His TOPO TA克隆载体,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α然后用指质体法转染Vero E6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定证明连续正确;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α成功构建及在Vero E6细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据。     

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

恶性疟原虫膜蛋白Pfs25在毕赤酵母中的组成型表达

目的:Pfs25蛋白是传播阻断型恶性疟疾疫苗的侯选抗原,在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白,并对表达产物进行鉴定。方法:参照GenBank中公布的pfs25基因序列,通过毕赤酵母喜好密码子分析人工合成目的基因;采取定向克隆策略构建重组表达质粒pfs25/pGAPZαA,经BstXⅠ线性化,电转染法转化酵母菌株GS115,在Zeocin抗性的筛选培养基上获得表达目的基因的pfs25/pGAPZαA/GS115重组酵母菌,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物;通过在YPD培养基上传代培养和目的基因表达,验证重组菌株的遗传稳定性。结果:在毕赤酵母中表达了Pfs25蛋白,且重组菌株遗传性质稳定。结论:为研制基于Pfs25蛋白的传播阻断型恶性疟疾疫苗奠定了基础。     

猪囊尾蚴疫苗候选基因TSO18在酵母中的高效表达

将猪带绦虫六钩蚴TSO18基因亚克隆至毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K_TSO18,电转化毕赤酵母菌GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,并对表达产物进行SDS_PAGE和Western blot分析、脱糖基化分析、分子筛纯化和小鼠免疫接种等表明,目的蛋白得到了高效表达并进行了适度的糖基化,易于纯化且具有免疫活性。在5L发酵罐中目的蛋白表达量达到2.54mg/mL,为制备基因工程疫苗打下了坚实的基础。     

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3基因在毕赤酵母中的表达及分析

旨在真核表达系统中高效表达柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶3(Eimeria tenella calcium-dependent protein kinase-3,EtCDPK3),获得有活性的天然蛋白,利用毕赤酵母表达系统对该基因进行了表达.将EtCDPK3基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-EtCDPK3.重组质粒通过电击转化入酵母细胞GS115后,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞.重组酵母细胞在含1％甲醇的BMMY培养基中诱导产生目的蛋白,培养收集1-4d的部分上清.经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白相对分子质量约为49 kD.Western blotting表明,该蛋白能与兔抗EtCDPK3血清特异性结合.结果表明,柔嫩艾美耳球虫CDPK3基因在毕赤酵母中成功地进行了表达.     

用毕赤酵母表达理氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因

目的:为提高β-葡萄糖苷酶的产量,用毕赤酵母取代理氏木霉用于生产,以弥补理氏木霉在大规模生产中的缺陷。方法:用套叠PCR法从理氏木霉基因组中扩增β-葡萄糖苷酶基因(bglⅠ)。用T4DNA连接酶和限制性DNA内酶将bglⅠ重组于P.pastoris表达载体pPIC9K的多克隆位点,获得含bglⅠ的重组表达载体pPIC9K-bglⅠ。通过电转法将其pPIC9K-bglⅠ载体转化于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性以及高表达bglⅠ酶的重组子作为工程菌。结果:用BMGY-BMMY培养基体系,在摇瓶中发酵48 h,表达BglⅠ30 mg/L,在P.pastoris中表达的BglⅠ能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷具有β-葡萄糖苷酶活性。其酶活力为56 U/L发酵液。结论:通过这种方法,可以成功地用毕赤酵母表达理氏木霉的β-葡萄糖苷酶基因。