Red/ET重组在基因打靶载体快速构建中的应用

通过合理应用Red/ET重组技术实现基因打靶载体的快速构建。在Red/ET重组介导下,首先从基因组DNA中将靶基因片段亚克隆至打靶质粒载体中,随后将两端带有50 bp同源臂的抗性筛选基因插入并替换靶基因上的目标序列,如此两步操作即可完成一个传统型基因敲除打靶载体的构建;结合Cre-loxP系统,在传统型基因敲除打靶载体的基础上,经过再一轮的Red/ET重组就能够成功实现条件性基因敲除打靶载体的构建。整个实验过程不需要PCR扩增长、短臂序列,也不涉及酶切、连接反应,因此,不仅省时、省力,而且所构建的基因打靶载体序列准确,无突变。此实验方法的建立为加速后基因组时代的基因功能研究提供了一条捷径。     

Red/ET 同源重组介导细菌人工染色体的快速修饰

随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体 (BAC) 进行有目的修饰,已成为功能基因组学研究的一个重要环节 . 应用新近优化的 Red/ET 同源重组技术对目标 BAC 进行修饰,以 pSC101-BAD-gbaA 为依托质粒,采用 rpsL-neo 为正 / 反向筛选系统,可以快速、高效地对 BAC 进行剪切、插入、替换等操作,其中能够进行抗性筛选的一步 BAC 修饰只需一周时间,以插入非抗性标记基因 Cre 为代表的两步 BAC 修饰在两周内即可完成 . 通过阿拉伯多糖诱导调控和简单地变化培养温度,能使 pSC101-BAD-gbaA 依托质粒在发挥完 Red/ET 同源重组作用后自然消失,最终获得完整而纯净的修饰后 BAC ,为加快功能基因组学研究提供了一个可靠的实验平台 .     

用Red/ET重组酶构建基因打靶载体

基因敲除的小鼠模型是研究基因功能的一种重要资源。采用常规分子克隆的方法建立基因敲除的打靶载体存在构建效率低和难以获得长片段同源臂的缺点。因此快速高效地构建打靶载体,已成为获得特定基因敲除动物模型的关键环节。为研究Resp18未知功能分泌肽基因,应用一种新的DNA工程平台——Red/ET同源重组技术来构建其打靶载体,并比较了这一方法在构建不同长度同源臂中的效率。研究表明,Red/ET重组方法构建打靶载体具有很高的效率,可以获得较长的同源臂,并且不会引入突变,有助于获得更高的打靶效率。因此Red/ET重组为构建打靶载体提供了一种新的可靠的方法。     

利用Red重组系统快速构建基因打靶载体

基因敲除小鼠模型是在哺乳动物体内研究基因功能最可靠的方法之一。利用常规的分子克隆的方法构建基因打靶载体往往工作周期长,对于难度特别大的基因有时甚至无法完成打靶载体的构建。通过合理应用Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆了长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了Gpr56等基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,实现了打靶载体的快速构建。     

利用Rde/ET技术构建表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒

【目的】本研究以火鸡疱疹病毒（HVT） BAC分子克隆为平台,构建表达禽流感HA基因的重组火鸡疱疹病毒,以开发新型病毒活载体疫苗。【方法】利用Red/ET重组技术,经过两步法重组：第一步,用两端带有50 bp大小左、右同源臂a和b的选择标记基因rpsL-neo表达盒替换HVT基因组US2区;第二步,用两端带有同样的50 bp左、右同源臂a和b的HA基因表达盒替换选择标记基因rpsL-neo表达盒。在含有氯霉素和链霉素双抗性的平板上筛选阳性克隆,经卡那霉素抗性反向筛选和PCR进一步鉴定,鉴定正确的克隆命名为pHVT-HA。提取并纯化pHVT-HA DNA,转染原代鸡胚成纤维细胞（CEF）,以完成重组病毒的拯救。【结果】命名为pHVT-HA3的BAC克隆转染CEF后第4天,出现病毒噬斑,噬斑形态与野生型HVT相似,获得拯救的重组病毒,命名为rHVT-HA3,将重组病毒rHVT-HA3在CEF上连续传代培养,经PCR和间接免疫荧光检测表明,重组病毒在连续传代过程中仍能稳定表达HA蛋白。【结论】本研究以HVT BAC为平台,利用Red/ET重组技术,构建了表达禽流感A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1) 毒株的血凝素（HA）基因的重组火鸡疱疹病毒,为新型禽流感重组活载体疫苗开发奠定基础。     

重组工程系统研究进展

大肠杆菌的同源重组依靠内源性的RecA蛋白。RecBCD降解双链线性DNA分子,因此必须构建环状质粒打靶载体才能完成体内重组,操作过程繁琐,所需同源臂长。最近建立起的依赖于Rac噬菌体的ET重组系统和基于入噬菌体的Red重组系统,可有效利用线性DNA片段作为打靶分子,对大肠杆菌染色体DNA和BAC、PAC载体中包含的真核细胞基因组DNA进行基因敲除、敲入、替换、单碱基突变及体内基因克隆等修饰。这2种系统重组效率高,用PCR方法便可合成双链线性DNA打靶分子,不需要限制酶和连接酶,操作过程简单、精确、快速、经济,大大缩短了构建打靶载体的时间,成为功能基因组研究的有力工具。     

基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装

本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3’端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法,并获得了一种IVa2基因大部分缺失的重组腺病毒。     

利用Red重组系统敲除鲍曼不动杆菌asa A基因

目的利用Red重组系统敲除鲍曼不动杆菌ATCC 17978的asaA。方法设计上下游引物中包含asaA的同源序列,并以pKD4质粒为模板,扩增含有卡那霉素抗性基因的DNA片段。将该片段转化于表达重组酶的17978感受态细胞中,在卡那霉素筛选压力下,得到经两次同源双交换的具有卡那霉素基因标记的突变菌株。随后,在重组酶的作用下将抗性基因去除,最终得到无抗性基因标记的突变菌株ΔasaA。结果通过该重组系统,首先将卡那霉素抗性基因的DNA片段替换了基因组中asaA的DNA片段,然后将卡那霉素抗性基因的DNA片段消除,最终获得了asaA缺失的突变体。结论通过Red重组系统为鲍曼不动杆菌中其他基因的缺失突变提供方法与思路。     

利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌rfaH基因

目的：利用λRed重组系统敲除伤寒沙门氏菌的rfaH基因。方法：以伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi Ty2,S.ty2）基因组为模板扩增得到的同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段共同构建同源重组载体;以重组载体为模板扩增打靶片段,将其转化S.ty2;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,打靶片段和菌体基因组发生同源重组,通过卡那抗性筛选得到带有抗性标记的重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以去除抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;通过PCR鉴定重组菌,并经透射电子显微镜分析表型。结果：在S.ty2中敲除了rfaH基因,经PCR扩增和序列测定正确;初步的表型分析表明突变体的鞭毛合成显著减少。结论：获得了S.ty2突变株,为将沙门氏菌进一步减毒成为疫苗表达载体奠定了基础。     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。     

基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装

本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3'端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red...     

利用Red系统快速改构含鼠β-酪蛋白基因的细菌人工染色体

采用Red系统介导的同源重组方法对含有鼠β-酪蛋白基因的RPCI23-440C1BAC进行快速改构。首先通过PCR方法,获得两端带有鼠β-酪蛋白基因同源序列的tPAm-Zeo同源重组片段,然后将此同源重组片段电击转化至已含有编码Red重组酶质粒的RPCI23-440C1BAC菌中,在λRed重组系统的帮助下,通过同源重组片段两端与RPCI23-440C1中β-酪蛋白同源的序列在菌体内与β-酪蛋白基因发生同源重组,将其置换。最后利用Zeocin抗性基因两侧的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将抗性基因剔除。经Southern blot和序列分析鉴定表明,获得了重组正确且无编码两种重组酶质粒的tPAm-RPCI23-440C1BAC克隆。     

利用细菌人工染色体同源重组对小鼠基因进行条件型敲除

目的:探索通过细菌人工染色体(BAC)同源重组系统构建条件基因敲除载体的高效率方法,提高条件基因敲除小鼠(Flox小鼠)的构建效率。方法:利用作者自己构建的噬菌体重组酶系统,通过BAC同源重组进行条件型基因敲除载体构建工作。首先通过亚克隆构建了一系列载体含有同源臂的靶向质粒,线性化后,打靶片段经电穿孔法转入大肠杆菌内,与相应的BAC同源重组,再经过三步同源重组和一步位点特异性重组,构建小鼠条件型基因敲除载体。结果:高效率构建了小鼠基因的最终条件基因敲除载体。结论:通过BAC同源重组高效构建条件基因敲除载体,为条件基因敲除载体的构建提供了全新思路,并为FLox小鼠的建立,及相应基因在发育、生理、致病机制等方面的功能研究奠定了基础。     

BAI1基因敲除打靶载体的快速构建

BAI1(脑血管生成抑制因子1)因其具有抑制血管生成的作用而得名,研究表明肿瘤的发生可能与BAI1的低表达有关.为了进一步探索BAI1的作用机制,运用改良的Red重组系统和低拷贝中间载体,利用50 bp的同源重组序列直接从BAC载体中克隆长片段的小鼠基因组序列;将得到的基因组序列再次通过重组和改造,构建了BAI1基因的完全敲除并带有报告基因的打靶载体,为后续的构建BAI1基因敲除小鼠模型、在动物体内研究基因功能奠定了基础.     

Red重组技术研究进展

主要从Red系统组成元件、作用机理、重组策略以及先进性和发展前景四个方面综述了利用Red 重组系统敲除或替换细菌染色体目的基因的方法。首先简要介绍了传统的细菌染色体重组技术,指出了其中的缺陷。然后提出了Red重组技术的定义：利用噬菌体Red系统介导来实现外源线性DNA片断与细菌染色体的靶基因进行同源重组的方法,外源线性DNA通常是PCR产物、寡核苷酸片断等,在它们的两翼各含有与染色体靶基因两翼同源的序列40~60bp。这种Red重组技术省去了体外DNA酶切和连接等步骤,使细菌染色体靶基因的敲除与替换操作相对简单,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。     

鼠伤寒沙门菌spvBC基因编辑株的构建

利用λRed重组系统和pBAD原核表达载体构建鼠伤寒沙门菌spvBC质粒毒力基因修饰菌株,为深入探究沙门菌毒力基因spv的功能和致病机制及宿主抗感染免疫提供工具菌。以pKD4为模板,PCR扩增含spvBC同源臂的卡那霉素抗性基因以构建同源打靶片段,再将其电转入含有质粒pKD46的鼠伤寒沙门菌中进行同源重组,随后将质粒pCP20电转导入阳性转化子,消除卡那霉素抗性基因,PCR鉴定敲除株的构建。PCR扩增含酶切位点的spvBC基因片段,扩增产物与原核表达载体pBAD/gⅢ分别双酶切后连接构建pBAD-spvBC重组质粒,PCR筛选阳性菌落并测序鉴定。将构建成功的pBAD-spvBC重组质粒电转导入spvBC敲除株中,Western blot测定不同浓度L-阿拉伯糖诱导SpvB和SpvC蛋白表达情况。PCR结果表明鼠伤寒沙门菌spvBC基因敲除成功;PCR及测序结果表明pBAD-spvBC重组质粒构建成功,Western blot结果表明13 mmol/L L-阿拉伯糖可诱导SpvB和SpvC蛋白正常表达。λRed重组系统可用于沙门菌质粒上大片段基因的敲除,pBAD原核表达载体可用于沙门菌质粒上大片段基因的回补,丰富了细菌质粒的基因修饰和编辑策略。     

人CCL20基因打靶载体的构建与鉴定

目的:构建针对人CC亚族趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20,CCL20)基因外显子2的置换型打靶栽体.方法:设计和合成引物,利用长距离聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)从永生化人角质形成细胞系(HaCaT)基因组DNA中克隆出CCL20基因组DNA片段,再以CCL20基因为模板扩增出长度为1969 bp的同源短臂和2356 bp的同源长臂.分别插入pioxP栽体的Neo基因上游和下游,构建针对人CCL20基因外显子2的置换型打靶载体(ploxP-hCCL20).将打靶载体线性化并以电穿孔方法转移入HaCaT,观察克隆的形成.结果:经过PCR、限制性内切酶鉴定及DNA序列测定.证实该载体的两条同源臂包含人CCL20基因的外显子1、3、4及其邻近的部分内含子.结论:ploxP-hCCL20载体构建成功,增加Neo基因下游同源臂长度的策略有可能提高细胞基因敲除的同源重组率.     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid,将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列）,以pKD3质粒（含cat）为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。