基于λ-Red重组酶系统的Ⅳa2基因缺失及重组腺病毒的包装

本研究用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法缺失腺病毒基因组上Ⅳa2基因的大部分编码序列(1104 bp),并获得一种Ⅳa2基因缺失的重组腺病毒。首先构建PCR打靶的含有卡那霉素抗性表达盒的模板质粒pAK,再以pAK为模板扩增出两端含39 bp同源臂的线性DNA片段;将pFG140质粒及线性DNA片段依次转化到宿主菌BW25113/pIJ790中,通过λ-Red重组酶介导的同源重组获得了缺失Ⅳa2基因的腺病毒基因组质粒pFG140-ΔⅣa2(1104)。酶切及DNA测序结果显示,用λ-Red重组酶介导的PCR打靶方法在pFG140上精确地缺失了预计的Ⅳa2基因3'端的1104bp片段。用PCR方法扩增获得Ⅳa2基因全长ORF,插入表达载体pAAV2neo中,构建成Ⅳa2基因表达质粒pAAV2neo-Ⅳa2。将pFG140-ΔⅣa2(1104)与pAAV2neo-Ⅳa2共转染HEK293细胞,成功地获得了重组腺病毒Ad5ΔⅣa2(1104)。Western Blot的结果表明,Ad5ΔⅣa2(1104)病毒感染的HEK293细胞检测不到Ⅳa2蛋白的表达。本研究建立了一种对腺病毒基因组直接进行缺失操作的λ-Red...     

一例罕见的X—常染色体平衡易位[46,X,t(Xq~+;15q~-)]伴发自然流产

有关夫妇一方为平衡易位携带者所致流产、死胎及先天性多发畸形的情况,近年来多见报道,并日益引起妇产科医师和医学遗传工作者的重视。绝大多数平衡易位发生在常染色体与常染色体之间,极少发生在X染色体与常染     

折叠式人工晶状体临床应用观察

目的:探讨白内障超声乳化摘除联合折叠式人工晶状体植入术的临床应用效果。方法:对109例(147只眼)白内障行超声乳化吸除术联合折叠式人工晶状体植入术,分别植入人工晶状体CANON STAARAQ-110NV型53眼、AMO S140NB型43眼、Pharmacia Ceeon 911型32眼、Alcon Acrysof型20眼。对术后视力、术前术后角膜散光、术后前房反应、人工晶状体位置、手术并发症进行观察。结果:术后6个月。矫正视力≥0.5眼数分别为94.3％、93.0％、90.6％、90.0％;术后6个月,AQ-110NV型和S140NB型、CeeOn 911型和Alcon Actysof型间角膜平均散光度数无显著差异,AQ-110NV型和S140NB型与Ceeon 911型和Alcon Acrysof型有显著差异(P<0.05);术后前房反应轻微;角膜水肿、后囊破裂、后囊混浊、人工晶状体破损,发生率分别为6.1％、4.1％、10.9％、3.9％;未发现人工晶体状体明显移位者。结论:各种材料的折叠式人工晶状体在临床上的应用都是有效的,推注式人工晶状体(AQ-110NV、S140NB型)植入术无须扩大切口,容易掌握,术后反应轻,并发症少,手术疗效满意。     

腺病毒载体介导的重组蛋白sTNFRII-gAD快速表达和制备

利用腺病毒载体高效感染哺乳动物细胞及表达外源基因的特性,建立一种快速高效表达及制备重组蛋白的方法,并用该方法获得sTNFRII-gAD (可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白) 蛋白纯品。首先用携带EGFP基因的腺病毒载体rAd5-EGFP以不同的腺病毒用量 (MOI) (0~1 000) 感染BHK21c022细胞,观察比较其转导效率和细胞毒性。用AdMax腺病毒载体系统制备携带融合基因sTNFRII-gAD的重组复制缺陷型5型腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD。用rAd5-sTNFRII-gAD以不同的MOI (0~1 000) 感染BHK21c022细胞,收取上清进行Western blotting分析,比较上清中sTNFRII-gAD蛋白的表达量。在此基础上,用rAd5-sTNFRII-gAD以MOI 100感染大量培养的BHK21c022细胞,在无血清培养条件下反复多次收取培养上清,经过硫酸铵浓缩、分子筛柱层析、透析等步骤浓缩和纯化sTNFRII-gAD融合蛋白,并体外测定该融合蛋白拮抗TNFa的活性。结果获得了携带sTNFRII-gAD融合基因的重组腺病毒rAd5-sTNFRII-gAD;用rAd5-EGFP感染BHK21c022细胞结果表明,随着腺病毒用量的增高,表达EGFP蛋白的BHK21c022细胞数量和亮度明显增加;MOI在0~100之间被感染的BHK21c022细胞未表现出明显的细胞毒性,MOI为1 000时可观察到细胞变圆和少量死亡现象。Western blotting分析结果表明,随着腺病毒用量的增高,培养上清中sTNFRII-gAD融合蛋白表达量明显增加,以MOI为1 000时最高。在此基础上,我们用MOI为100的rAd5-sTNFRII-gAD感染5个转瓶培养的BHK21c022细胞以制备sTNFRII-gAD融合蛋白。每个转瓶加无血清培养液100 mL,每48 h收获上清1次并换液,反复6次收取培养上清共约3 L,经过纯化获得了约11 mg的sTNFRII-gAD融合蛋白。体外活性测定实验表明,获得的sTNFRII-gAD融合蛋白能有效拮抗TNFα对L929细胞的杀伤作用。腺病毒载体/BHK21细胞表达系统是一个简便、高效、通用的表达系统,利用该系统成功制备了有生物学活性的sTNFRII-gAD融合蛋白。该表达系统的特点是生产规模易于放大,适应无血清培养,可以反复多次收获目标蛋白。     

1997-2010年小儿肺炎克雷伯菌耐药性变迁分析

目的 了解1997-2010年肺炎克雷伯菌(KPN)在儿科及新生儿科临床感染中的流行状况及耐药性.方法 收集珠海市妇幼保健院儿科及新生儿科1997-2010年临床痰液标本中分离的肺炎克雷伯菌共633株,分析其对常用抗生素的耐药性.并分析2005年以后产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)与不产ESBLs肺炎克雷伯菌株耐药性的差异.结果 根据14年来该院临床分离的肺炎克雷伯菌药敏试验结果显示,该菌对氨苄西林及哌拉西林的耐药率最高,可达100％.对头孢他啶、头孢吡肟的耐药率各年有波动,但总体无明显变化(分别约28％、34％).对儿科临床限制使用药物如庆大霉素、左旋氧氟沙星、氯霉素、复方新诺明等耐药率呈逐年下降趋势.14年来尚未发现对亚胺培南耐药的KPN.2005年以后产ESBLs菌株的检出率呈逐年增高趋势(17％ ～38.7％),且对各种抗生素的耐药率较普通KPN明显增高.结论 肺炎克雷伯菌对临床常用β-内酰胺类抗生素耐药率高,儿科限制使用药物的耐药率有逐年下降趋势,产ESBLS菌株耐药情况严重.     

新辅助化疗与营养支持对老年结肠癌患者T 细胞，COX-2 及tM2-PK水平的影响

目的：探讨新辅助化疗与营养支持综合治疗对老年结肠癌患者血清肿瘤标记物水平、COX-2 及生活质量影响及临床意义。 方法：选取我科收治的老年结肠癌患者80 例,根据治疗方案不同分为对照组与试验组。对照组常规行结肠癌根治切除术,试验组 应用FOLFOX3 方案。比较两组患者血清肿瘤标记物CEA 及CA19-9 水平、COX-2 水平及CD4+、CD8+及tM2-PK 水平。结果：与 治疗前相比,治疗后试验组和对照组CEA 及CA19-9 水平降低（P<0.05),COX-2、tM2-PK 水平降低（P<0.05),CD4+及CD4+/CD8+ 水平降低（P<0.05),CD8+水平升高（P<0.05)。与对照组比较,试验组COX-2、tM2-PK 水平、CD4+、CD8+水平改善明显优于对照组, 差异具有统计学意义（P<0.05),而CEA 及CA19-9 水平组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论：新辅助化疗与营养支持综合 治疗可杀伤老年结肠癌患者全身不可见转移肿瘤细胞,控制病情,临床疗效理想。     

一例罕见的X-常染色体平衡易位[46,X,t(Xq;15q]伴发自然流产

有关夫妇一方为平衡易位携带者所致流 产、死胎及先天性多发畸形的情况,近年来多见 报道,并日益引起妇产科医师和医学遗传工作 者的重视。绝大多数平衡易位发生在常染色体 与常染色体之间,极少发生在X染色体与常染 色体之间。由于X染色体对性发育的特殊影 响,所以这种少见类型的染色体易位更引人重 视。迄今为止,国内有关资料中尚未见X一常 染色体易位类型的报道。我们在为一对不明原 因自然流产的夫妇作外周血染色体检查中发现 女方的染色体核型为46, X, t (Xq+; 15q )o 现报道如下,并对某些平衡易位中的染色体部 分失活现象进行讨论。     

巨噬细胞外泌体在增殖性糖尿病视网膜病变中的研究进展

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病患者最常见的微血管系统并发症之一，是视力丧失的主要原因。增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)是DR的终末期表现，其主要的病理生理学特征是视网膜新生血管形成(retinal neovascularization, RNV)。但PDR现有治疗方式存在局限性。外泌体作为细胞间沟通交流的重要使者，其携带的非编码RNA和生物活性蛋白质等重要信号分子，通过影响血管内皮细胞的增殖和迁移，在RNV中发挥关键作用。巨噬细胞是一种多功能调节细胞，越来越多的研究表明巨噬细胞外泌体在调控新生血管形成中起重要作用。该文就巨噬细胞外泌体在增殖性糖尿病视网膜病变形成中的作用与机制研究进展进行综述。