中国农大小型猪胰淀素基因部分未知序列扩增与分析

目的扩增中国农大小型猪IAPP基因序列,分析其序列结构特点。方法提取中国农大小型猪血液基因组DNA,设计3对特异性引物进行PCR扩增,产物鉴定、测序和同源性比对分析。结果成功扩增出中国农大小型猪IAPP基因的1028bp的序列。结论经同源性比对分析显示,中国农大小型猪与人的IAPP基因的同源性为77%。     

甘肃本地产当归、黄芪和大黄的rDNA ITS序列分析

本研究采用改良CTAB法分别提取18份甘肃本地产当归、黄芪和大黄基因组DNA,并用PCR分别扩增其ITS1-5.8S-ITS2序列、直接测序并作序列同源性比对分析。双向测序分析结果表明,甘肃6个不同产地当归rDNA的ITS1、5.8S和ITS2序列一致,片段长度分别为215bp、162bp和223bp;供试的黄芪ITS1、5.8S和ITS2序列分别为228bp、164bp和210bp;大黄ITS1、5.8S和ITS2序列分别为160bp、159bp和164bp。供试材料的ITS1-5.8S-ITS2核苷酸序列已提交GenBank。本研究为提供甘肃当归、黄芪和大黄指纹图谱鉴别的分子标记、其道地性药材的分子鉴定和品质评价提供参考。     

苹果炭疽菌的分子鉴定与检测

测定苹果炭疽菌rDNA全序列,比对苹果炭疽菌和其它炭疽菌ITS序列以及构建系统关系树,发现苹果炭疽菌与胶孢炭疽菌的ITS序列相似性高达99．8％,并与胶孢炭疽菌聚在一起,可以明确苹果炭疽菌应属于胶孢炭疽菌。进一步的序列比对发现,苹果炭疽菌的18S rDNA3’端比其它胶孢炭疽菌多出一段379bp的序列,根据这一特有片段设计引物CgF1与通用引物ITS4配对,结果仅能从苹果炭疽菌中扩增出1232bp的特异性条带。用苹果炭疽菌接种离体苹果,以接种发病的病组织总DNA为模板,利用引物CgF1／ITS4进行PCR扩增,同样可以扩增出1232bp的特异性条带,而健康苹果组织DNA中未能扩增出任何条带,表明该方法可用于苹果炭疽菌的鉴定和快速检测。     

真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值评价

目的 对真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值进行评价.方法 收集中山大学附属第一医院2012年1月至2012年8月间分离的丝状真菌11株,使用真菌通用引物Its1和Its4采用PCR法扩增核糖体基因,对PCR产物进行序列测定,将测序结果与GenBank中已知标准或临床菌株DNA序列比对,确定丝状真菌的菌种;同时与传统形态学鉴定方法进行比较,从而对真菌通用引物Its1和Its4在丝状真菌鉴定中的价值进行评价.结果 从DNA提取到序列测定结束,在2个工作日内即可完成.所有菌株均测序成功,测序结果与GenBank中的序列比对,烟曲霉、杂色曲霉、橘青霉、溜曲霉可以鉴定到种;黄曲霉和米曲霉、阿姆斯特丹散囊菌和冠突散囊菌由于高度同源性无法区分鉴定到种.结论 利用真菌通用引物Its1和Its4结合PCR技术和测序技术,可快速、准确将大部分丝状真菌鉴定到种.     

人传染性软疣病毒快速PCR检测方法的建立

为了能够对传染性软疣病毒(MCV)感染做出准确快速的实验室诊断,从14例临床MCV患者皮疹处提取获得病毒DNA,设计引物并进行PCR扩增获得预期的167bp的片段,经测序并与已报道的序列比对,完全一致。而使用痘病毒科其他病毒的特异引物(正痘病毒和副痘病毒属)则没有特异扩增条带。将病毒DNA进行系列稀释后行PCR扩增,结果表明PCR检测方法的敏感性为5×10-4ng/μL。     

贵州桐梓何首乌rDNA ITS序列分析

以改进的CTAB法对何首乌总基因组DNA进行提取,采用通用引物对不同来源的何首乌rDNA ITS序列进行PCR扩增、测序和序列分析.结果表明,何首乌rDNA完全序列片段长度共约652 bp,其中ITS1的长度为202 bp,5.8S的长度为161 bp,ITS2长度为232 bp,与其近缘种ITS序列间存在明显差异.其rDNA ITS序列在分子水平上为鉴别何首乌提供了参考依据.     

复合PCR扩增人mtDNA HVR方法的初探

目的:建立一种高效的扩增线粒体DNA高可变区(mtDNA HVR)的方法.方法:本研究选取5例健康成人静脉血,用人血全基因组DNA试剂盒,提取全基因组DNA,设计引物,用复合PCR方式,对线粒体DNA中的高可变区进行扩增.复合扩增的方式为:用6对套叠引物分开进行两次独立的PCR,扩增mtDNA HVR.第一次扩增用3对引物,目标DNA片段基本涵盖整个线粒体DNA的高可变区,扩增后得到互不重叠的3个短片段,分别为113 bp,126 bp和131bp.第二次复合扩增用其余的3对引物,目标片段基本重叠在第一次扩增所得的目标片段的区域内,扩增得到3个互不重叠的片段为124 bp,133 bp和93bp.所有扩增产物经过纯化后测序.结果:复合PCR方式获得的mtDNA HVR基因序列完整,5个样本均出现特异性条带,电泳结果条带单一、清晰.结论:复合扩增PCR方法对mtDNA HVR区的扩增效率高,测序结果稳定,结合6对套叠引物,不但保证了序列的完整性,另外,两次独立的PCR也减少了PCR反应过程中错配的发生,此法也适用于保存时间较久的古代线粒体DNA短片段的研究.复合扩增PCR还展示出了潜在的高产量的特点,相对传统PCR显示了其更多的优势.     

毛囊蠕形螨与皮脂蠕形螨基因组DNA的RAPD分析和序列比对

【目的】分析毛囊蠕形螨Demodex folliculorum（D.f.）和皮脂蠕形螨D. brevis（D.b.）基因组DNA的多态性, 对相关条带进行测序分析。【方法】采用改良小昆虫DNA提取法提取两种人体蠕形螨基因组DNA, 选择RAPD技术对其进行多态性分析, 将相关条带分别与pMD18-T载体连接, 克隆、测序后进行酶切鉴定和分析。【结果】毛囊蠕形螨共扩增15条带, 皮脂蠕形螨共扩增12条带;两种蠕形螨既有共有条带, 又有特异性条带;根据条带差异计算得到两种间的遗传距离为0.5556. 毛囊蠕形螨约800 bp处特异性条带测序结果显示, 序列片段长度为855 bp（GenBank登录号为FI277970）;特异性引物扩增和酶切鉴定均为毛囊蠕形螨所特有. 序列比对显示与阿糖胞苷DNA区域结合蛋白有46%的序列相似度。两种人体蠕形螨约300 bp处共有条带序列分析显示, 碱基序列均为341 bp（GenBank登录号分别为D.f. FI520176;D.b. FI520175）, 在第84和第165位点有2个碱基不同, 分别是A/G和C/T互换, 同源性高达99.4%. 但未发现有开放阅读框和相似度高的序列。 【结论】序列片段为855 bp的特异性条带为毛囊蠕形螨所特有;341 bp碱基序列为毛囊蠕形螨和皮脂蠕形螨所共有, 同源性高达99.4%. RAPD技术可用于两种人体蠕形螨基因组DNA的多态性分析和物种鉴定。     

白背飞虱、灰飞虱mariner转座子的初步研究

根据毛里塔尼亚果蝇Drosophila mauritania的mariner转座子序列设计简并引物,以白背飞虱Sogatella furcifera和灰飞虱Laodelphax striatellus基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增出了约500 bp的条带,经回收、克隆、测序,获得其核苷酸序列,与毛里塔尼亚果蝇mariner序列相比,核苷酸同源性均为71.3%,氨基酸同源性分别为69.5%和72%,证明白背飞虱和灰飞虱体内确实存在mariner转座子。     

牛β-酪蛋白5′端上游调控序列的克隆和序列分析

该文用PCR扩增了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列,并对其进行了克隆和序列分析。采集成年母牛肝,提取DNA。在牛β－酪蛋白基因外显子1和上游调控区内设计引物,扩增其上游调控序列。两条引物长均为19个核苷酸,引物间跨度为635bp。以牛肝DNA为模板,进行PCR扩增,扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳,可见特异的目的条带。从凝胶中回收目的片段,克隆到pGEM－T载体中。重组质粒提取DNA,进行序列分析。测序结果与文献发表的类似序列相比,仅有4个碱基不同,同源性达99．4％。表明获得了牛β－酪蛋白基因5′－端上游调控序列的克隆。     

维吾尔族正常黑胆质人群肠道菌群的分布情况分析

目的：了解维吾尔医学正常黑胆质人群肠道菌群分布情况、多样性并优势菌。方法：对健康人进行维吾尔医学体液分型并挑 取其中正常黑胆质人群,采集受检者粪便样品,提取总DNA,设计一对通用引物扩增16S rDNA 的V6～V8 可变区,扩增出来的 PCR产物稀释并进行变形梯度凝胶电泳DGGE,从DGGE 指纹图谱中选择条带,切胶回收、克隆、序列测定。结果：通过实验得到 了反映肠道菌群结构特征的DNA指纹图谱,从指纹图谱上选择一些特异性条带切下来回收,重新纯化扩增出来并测序,测出来 的基因序列在基因库进行比对检测相似性程度。最终用相似性程度大于95%以上的序列比对做出进化树了解菌群之间的亲缘 性。结论：正常黑胆质人群肠道菌群基因序列的亲缘性结果显示黑胆质人群肠道菌群具有丰富的多样性,其中肠道优势细菌乳酸 杆菌属GU269544.1 占优势。     

苹果蠹蛾线粒体DNA COⅠ基因克隆与序列分析

本研究采集新疆阿拉尔地区苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)幼虫,对其线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)基因进行了扩增、克隆和测序,并对COⅠ序列进行了分析。结果显示:苹果蠹蛾DNA扩增出的COⅠ基因序列片段长度为709bp,序列中A+T含量极高,占68.7%,而G+C的含量只有31.3%。经基因序列比对,与其它几种食心虫的同源性为85.4%～88.1%,遗传距离为0.130～0.162;采用NJ法构建了卷蛾科系统树,所得的聚类结果与传统的分类结果基本一致。本研究结果为苹果蠹蛾快速鉴定的DNA条形码技术研究提供重要基础。     

扬子鳄鞣制皮革和鳞片的DNA提取方法

运用一种改进的提取方法 ,作者从鞣制皮革中成功地提取了总DNA ,同时还对尾尖皮、鳞片、盐腌生皮等皮质进行了DNA提取 ;用 12SrRNA基因扩增的通用引物、扬子鳄鉴别引物、微卫星引物及RAPD引物进行PCR扩增 ,并对部分扩增结果进行测序 ,以检验提取效果。结果证明 ,几种皮质标本都可提取出DNA ,其中尾尖皮和鳞片的提取效果较好 ,用四种引物都可扩增出明显亮带 ;盐腌生皮和鞣制皮提取结果也很好 ,并且用12SrRNA通用引物、扬子鳄鉴别引物扩增的亮带较明显 ,可进行扬子鳄皮质用品等的分子鉴定及部分序列的扩增和测序研究     

采用苯酚羟化酶基因特异引物检测苯酚降解菌

根据苯酚羟化酶基因高度保守序列设计了一对该基因的特异PCR引物。采用该特异引物从苯酚降解菌醋酸钙不动杆菌 (Acinetobactercalcoaceticus)PHEA 2的总DNA中扩增到唯一一条大小为 684bp的片段。该DNA片段与已知的A .calcoaceticusNCIB82 50的苯酚羟化酶基因具有高度的同源性 ,其核苷酸序列的同源性为 84% ,推导的氨基酸序列的同源性为 98%。对苯酚和非苯酚降解菌株的PCR扩增结果表明 :所有苯酚降解菌均能扩增出 684bp的特征片段 ,而非苯酚降解菌则无PCR条带。对炼焦废水中的细菌群落进行PCR扩增和生化特性检测表明 :显示 684bp特征片段的菌株均具有苯酚降解特性。上述结果表明 ,利用苯酚羟化酶基因的特异引物可对环境中的苯酚降解菌株进行准确快速的PCR检测。     

不结球白菜新种质P70-203雄性不育细胞质类型的鉴定

本研究根据OguraCMS、PolimaCMS的不育性状相关的线粒体基因序列设计特异引物,对不结球白菜雄性不育系新种质P70-203及其保持系P60-27-1进行PCR分析.研究结果表明,Polima引物P3/P4,P5/P6在不育系与可育系中均无扩增条带;Ogura引物P1/P2在不育系中扩增出750 bp的特异片段,但可育系中无扩增条带.将扩增的特异条带回收并测序,将得到的测序结果在NCBI中进行Blastn同源性比较,结果与青花菜Ogura(登录号:EU604643)和萝卜Ogura(登录号:AB055438)细胞质雄性不育同源性均达到99%.从分子角度初步推测:该雄性不育系新种质P70-203具有Ogura细胞质.     

利用两种不同引物扩增金龟子COⅠ序列片段的研究与对比

利用两类不同的引物,即通用引物(L1490,H2198)与特异引物(Pat,Jerry)分别对4种常见金龟子线粒体细胞色素C氧化酶I(COⅠ)基因片段序列进行扩增和测序,获得长度为689 bp与775 bp的序列。对测序结果进行遗传距离分析,并构建了4种金龟子系统进化树。结果表明,特异引物扩增序列的遗传距离在种内稳定性与种间的差异性都明显优于通用引物扩增序列,利用特异引物扩增序列所构建的系统进化树最符合实际情况,因此利用特异引物扩增序列更能够准确的对金龟子进行分类。     

几种尖孢镰刀菌专化型中SIX1、SIX4、SIX6、SIX8同源基因分析

尖孢镰刀菌在与寄主的相互作用中分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白进入木质部中启动致病力,被称为SIX(secreted in xylem)蛋白,为明确其在不同寄主中的作用,本研究比较分析了几种尖孢镰刀菌专化型中SIX1、SIX4、SIX6、SIX8同源基因序列。根据已完成的尖孢镰刀菌古巴专化型1号(Foc1)与4号生理小种(Foc4)全基因组测序序列信息及相关SIX基因序列设计引物,应用PCR方法扩增分析56株尖孢镰刀菌古巴专化型与18株其它专化型及非致病型尖孢镰刀菌菌与其它种或属共21株菌株中的SIX1、SIX4、SIX6、SIX8基因。结果表明:设计的SIX1、SIX4、SIX6、SIX8基因引物均不能从非致病性尖孢镰刀菌与其它镰刀属种或其它属的菌株DNA中扩增出目的条带;SIX1基因的2个引物均能从供试的Foc菌株DNA中扩增出目的条带,同时可从部分其它专化型菌株DNA中扩增出目的条带;SIX4基因引物仅能从供试的尖孢镰刀菌番茄专化型与部分甘蓝专化型菌株DNA中扩增出目的条带;SIX6引物仅能从供试Foc1、Foc2、Foc4菌株DNA中扩增出目的条带;SIX8基因引物能从所有供试的致病尖孢镰刀菌中DNA扩增出目的条带。研究发现的SIX6基因序列提供了快速鉴定尖孢镰刀菌古巴专化型的检测方法,同时为深入研究尖孢镰刀菌各个专化型中SIX基因的功能奠定基础。     

一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌方法的建立与初步评价

目的建立一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法。方法采用经全自动微生物鉴定系统和分子生物学方法准确鉴定的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌各3株,提取细菌DNA,PCR扩增tuf基因,扩增产物Alu I、Hinf I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,分析不同葡萄球菌酶切后带型的差异。收集临床分离葡萄球菌142株,采用建立的PCRRFLP对其进行分类鉴别,随机选择分类鉴别的葡萄球菌各20株,PCR扩增16S r DNA,扩增产物测序,将结果与Gen Bank数据库进行比对,初步评价该方法的准确性。结果金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,溶血葡萄球菌均能扩增出长668 bp DNA片段。扩增产物经Alu I、Hinf I双酶切后电泳条带不同,金黄色葡萄球菌出现三条带（108 bp/192 bp/217 bp）,表皮葡萄球菌出现两条带（192 bp/304 bp）,溶血葡萄球菌出现两条带（192 bp/217 bp）。PCR-RFLP结果显示,142株葡萄球菌中金黄色葡葡球菌、表皮葡葡球菌和溶血葡葡球菌分别为67、29和46株。随机挑选的20株不同种葡萄球菌16S r DNA测序结果与Gen Bank数据库对应序列的相似性均〉99%,说明建立的PCR-RFLP方法能准确区分三种常见葡萄球菌。结论 PCRRFLP能准确鉴别临床常见的致病性葡萄球菌,为葡萄球菌病的分子诊断奠定了基础。     

随机扩增多态性DNA技术在鲍氏层孔菌菌株鉴别中的应用

用20个随机引物对7个不同来源的鲍氏层孔菌菌株进行了RAPD分析．结果表明120个随机引物中,有17个引物的扩增产物DNA条带表现出明显的多态性,不同引物对供试菌株扩增出现的DNA条带数目少则10条,多达33条．DNA片段从250bp到2000bp;采用17个引物对7个鲍氏层孔菌菌株共扩增出DNA片段带377条,不同引物扩增出的DNA片段谱带存在较大差异．采用UPGMA系统聚类法,将7个菌株聚类为两大类,能直观准确地揭示菌株间的差异并加以鉴别．     

16S rRNA PCR鉴定脆弱类杆菌

目的:应用16SrRNA序列设计PCR引物鉴别脆弱类杆菌。方法:通过脆弱类杆菌16SrRNA序列特异性位点设计引物,对4株脆弱类杆菌及大肠杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌等进行PCR扩增。应用琼脂糖电泳法对PCR扩增产物进行特异性检测。结果:脆弱类杆菌在176bp左右出现特异性条带,而其他细菌均未出现特异性条带。结论:通过16SrRNA序列中特异位点设计引物进行PCR,可特异性鉴定脆弱类杆菌。