RNA干扰技术及其在肝纤维化中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近几年发展起来的新技术,是外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,因而抑制相应基因表达,导致转录后基因沉默的现象.尽管RNA干扰发现的时间较短,但由于其具有操作简单、成本低、特异性高和高效性等特点,因而发展迅速.小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的可制备使RNAi在很多领域有了应用的前景,尤其是在复杂多变的肝脏疾病中.肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是多种慢性肝病发展的共同病理基础,RNAi技术在其基因治疗领域拥有广阔的前景.RNAi具有能够调节细胞增殖、抑制致病基因的表达、影响细胞的信号转导等方面的作用,可能成为肝纤维化有效的潜在治疗手段.     

RNA干扰技术在基因治疗中的应用进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种双链RNA分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程,在基因治疗方面有着无可比拟的优势,已成功的应用于肿瘤、病毒感染、遗传性疾病及神经系统疾病等重大疾病的治疗.本文将主要介绍siRNA基因治疗的导入方法与途径,以及在不同疾病中,RNAi技术进行基因治疗的应用.     

细胞内表达的小干扰RNA靶向丙肝病毒5′保守区的研究

将丙型肝炎病毒(HCV)基因组的5′非编码区(5′UTR)插入到报告基因绿色荧光蛋白(eGFP)和荧光素酶(luciferase)的上游,并构建基于Ⅲ型启动子的表达载体,这种载体能产生针对HCV 5′UTR的小干扰RNA.然后将含有HCV 5′UTR的eGFP/luciferase和能产生小干扰RNA的质粒共转染入Hela细胞,通过测定细胞发出的荧光和化学发光强弱来观测抑制效果.实验结果表明,与HCV 5′UTR特异性小干扰RNA表达质粒共转染的细胞无论从定性还是从定量上所测得的荧光和化学发光强度都明显低于阴性对照,且细胞密度经核染色与对照组无明显区别.这揭示了小干扰RNA确实能引起HCV特异基因如5′UTR的沉默,且转染进去的小干扰RNA表达质粒对细胞没有毒害作用.这一工作是通过载体直接在细胞内表达小干扰RNA(siRNA)而不是化学合成的,可以使小干扰RNA在细胞内得到稳定表达,因此本研究设计的siRNA表达载体不仅可以有效沉默HCV 5′UTR,而且该系统可以灵敏地筛选更有效的针对HCV的siRNA,因而这一结果为研究利用RNA干扰进行基因治疗HCV感染做了初步探索.     

RNA干扰用于基因治疗的研究进展

RNA干扰(RNAi)是20世纪末才被人们认识和重视的一种通过双链RNA抵御病毒入侵或抑制转座子活动的生物防御机制。随着RNA干扰分子机制研究的深入及其应用研究的发展,人们发现RNA干扰技术在基因功能研究及人类疾病的基因治疗上具有广阔的应用前景。本文在简述RNAi分子机制的基础上,综述了RNAi在抗病毒治疗及抗肿瘤治疗方面的研究和应用概况。     

Survivin的研究现状与RNA干扰在基因治疗中的进展

Survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白,在正常组织中不表达而在恶性肿瘤中高表达,与肿瘤的预后、复发、转移关系密切,具有调控细胞周期,凋亡和增殖的作用;还与对化疗的耐药性和放疗的敏感性有关;此外,与肿瘤新生血管的形成关系也十分密切.针对Survivin这些特性,应用新的基因治疗技术-RNA干扰技术降低Survivin的表达可对肿瘤组织的凋亡和增殖产生影响,由于RNA干扰技术具有的高效性,特异性,长效性,使它成为肿瘤基因治疗的重要方法,应用RNA干扰技术针对Survivin靶位降低Survivin的表达有望成为今后肿瘤基因治疗的方向.     

RNA干扰在疾病治疗上的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种双链RNA分子在mRNA水平上引发的特异性基因沉默现象。RNAi在基因治疗方面表现出了光明的前景,已成功地应用于多种疾病的临床治疗。本文主要介绍了RNAi在疾病治疗上的应用及研究进展。     

RNA干扰技术及其应用前景

细胞固有的对抗外源基因及其侵害的一种自我保护现象称RNA干扰,即在mRNA水平双链RNA分子关闭相关序列及基因表达使其沉默的过程。具有高效性、特异性等特点。本文综述了RNA干扰技术及其作用机制,包括它的作用特点,并在此基础上展望了它在基因组学研究和医学领域上的重大价值。     

病毒研究的崭新技术--RNA干扰

RNA分子可参与生物体细胞许多基本的生理活动,继发现核酶、肽核酸和反义RNA等之后,近未有关小干扰RNA及其所致的RNA干扰现象又成为研究热点。小干扰RNA是dsRNA被DICER降解后产生的长19～23核苷酸的小RNA片段,具有5′—磷酸、3′——羟基和2个核苷酸(dTdT或UU)的3′端;而RNA干扰则是由小干扰RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象,其本质是小干扰RNA与对应的mRNA特异结合,形成降解,从而阻止mRNA的翻译。RNA干扰是生物进化的结果,是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。当病毒在宿主细胞内进行复制时,病毒RNA可被降解成小干扰RNA,从而在细胞内产生的RNA干扰,通过RNA干扰的作用抑制病毒的增殖。     

RNA干扰与抗病毒感染

RNA干扰(RNAi)是由小干扰RNA(siRNA)引发的生物细胞内同源基因的转录后基因沉默(PTGS)现象,是一种古老的生物抵抗外在感染的防御机制。RNAi因其在维持基因组稳定、调控基因表达和保护基因组免受外源核酸侵入等方面发挥的重要作用,已被广泛用于探索基因功能、基因治疗和新药的研发。外源导入siRNA引发的RNAi可以特异性抑制病毒的复制与感染,为抗病毒感染治疗开辟了一条新的途径。     

RNA干扰的研究进展及应用

RNA干扰(RNAi)是生物体的一种在进化上保持高度保守的,能抵御外源基因或外来病毒侵犯的重要防御机制,是一种序列特异性的转录后基因沉默现象。它由双链RNA引发,广泛存在于动、植物等各种生物体内。我们简要综述了RNAi发生的机制、特点、哺乳动物与RNAi现象,以及RNAi的应用等。     

Potent RNAi by short RNA triggers

RNA interference (RNAi) is a gene-silencing mechanism by which a ribonucleoprotein complex, the RNA-induced silencing complex (RISC) and a double-stranded (ds) short-interfering RNA (siRNA), targets a complementary mRNA for site-specific cleavage and subsequent degradation. While longer dsRNA are endogenously processed into 21- to 24-nucleotide (nt) siRNAs or miRNAs to induce gene silencing, RNAi studies in human cells typically use synthetic 19- to 20-nt siRNA duplexes with 2-nt overhangs at the 3′-end of both strands. Here, we report that systematic synthesis and analysis of siRNAs with deletions at the passenger and/or guide strand revealed a short RNAi trigger, 16-nt siRNA, which induces potent RNAi in human cells. Our results indicate that the minimal requirement for dsRNA to trigger RNAi is an ~42 Å A-form helix with ~1.5 helical turns. The 16-nt siRNA more effectively knocked down mRNA and protein levels than 19-nt siRNA when targeting the endogenous CDK9 gene, suggesting that 16-nt siRNA is a more potent RNAi trigger. In vitro kinetic analysis of RNA-induced silencing complex (RISC) programmed in HeLa cells indicates that 16-nt siRNA has a higher RISC-loading capacity than 19-nt siRNA. These results suggest that RISC assembly and activation during RNAi does not necessarily require a 19-nt duplex siRNA and that 16-nt duplexes can be designed as more potent triggers to induce RNAi.     

RNAi技术降低头孢菌素C工业生产菌株中cefG基因的转录

RNAi是近年来新兴的一种通过抑制基因转录水平来实现特定基因表达沉默的技术。本研究尝试在顶头孢霉工业生产菌株中利用RNAi技术沉默cefG基因的转录,构建了一个含可形成cefG双链RNA转录单元的质粒,并将其导入头孢菌素C工业生产菌株中。结果发现其中两个转化子的cefG基因转录水平在发酵第4天较出发菌株降低了80%以上,而它们的头孢菌素C发酵水平较出发菌株则分别降低了34.6%和28.8%。     

RNAi 在植物功能基因组中的应用

植物生物学后基因组时代的主要目标就是确定植物基因组中所有基因所具有的功能。解决这个问题的一个最直接的方法就是还原或者敲除某个在正常条件下其功能能表达出一定的可观察到的表型的特殊基因。对于这方面的研究,插入突变技术就是一个可用的工具,但是基因的随机性,致死敲除,无标记的突变体都大大地限制了这种技术的利用。RNm技术可以克服以上那些难题。它已经被广泛地应用在线虫的功能基因组上,并且所获得的有效资源还被广泛地用于植物功能基因组的分析。     

昆虫几丁质合成及其调控研究前沿

几丁质合成与降解是昆虫最重要的生理过程之一。本文根据国外和作者自己的研究,综述了昆虫几丁质合成及其调控研究进展。昆虫几丁质的生物合成通路始于海藻糖,终止于几丁质,其中共有8个酶参与。目前研究最多的为海藻糖酶和几丁质合成酶。昆虫存在2个海藻糖酶基因和2个几丁质合成酶基因。可溶性海藻糖酶基因对昆虫表皮的几丁质合成影响更大,而膜结合海藻糖酶基因则主要影响中肠的几丁质合成。几丁质合成酶A主要负责表皮和气管几丁质的合成,而几丁质合成酶B则负责中肠围食膜的几丁质合成。目前,昆虫几丁质合成的调控途径主要有两种:利用RNAi技术和几丁质合成抑制剂。     

病毒逃避宿主抗病毒反应的新策略

病毒与它们的宿主已经共进化了上百万年,在共进化的过程中,病毒发展了许多不同的策略对抗和逃避宿主的抗病毒反应.最新证据表明,病毒可以通过参与RNA干扰（RNA interference,RNAi）途径来介导潜伏感染、调节凋亡、逃避细胞毒T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）反应和逃避RNAi的抗病毒效应,从而逃避宿主的抗病毒反应.深入理解病毒逃避抗病毒反应的策略,不仅有助于理解病毒的致病机制及针对新的靶标设计抗病毒药物,而且有助于针对病毒的逃避机制制定相应的对策.     

RNAi在药物研究中的应用

RNA干扰是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性的转录后基因表达沉默。在哺乳动物细胞里,RNAi可以由21-25个核苷酸长度的小干扰RNA（siRNA）触发,在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中具有广阔的应用前景。现针对近年RNAi在药物研究中的应用包括应用RNAi发现新药靶、辅助确认药靶、RNAi药物、RNAi与耐药性等方面作一综述。     

RNAi抑制肝星状细胞TIMP-1基因表达及对细胞生物学行为的影响

研究了siRNA对大鼠肝星状细胞（CFsC）TIMP-1基因表达及对细胞生物学行为的影响．用RT—PCR方法获得带有T7启动子的TIMP-1全基因序列,体外转录法获得TIMP-1dsRNA,Dicer酶切后得到siRNA,用质脂体将siRNA转染至CFSC．RT—PCR检测TIMP-1mRNA的表达,MTT方法检测细胞生长,流式细胞仪检测细胞凋亡．结果成功获得TIMP-IsiRNA,将TIMP-1siRNA转染至CFSC12、24、48h后,与对照相比,TIMP-1mRNA的表达逐渐下降．经OuanityOne（BIO—RAD,USA）分析后,其抑制率分别为49.18％、58．72％和64．73％;siRNA转染CFSC细胞后,CFSC生长受到抑制,细胞凋亡不明显．实验结果表明体外转录法得到的siRNA能有效地降低大鼠CFSC中TIMP-1的表达．明显抑制CFSC的增殖,但不直接引起CFSC的凋亡。     

β分泌酶RNA干扰质粒的构建与鉴定

选择人、小鼠和大鼠的BACEI基因的共有序列为干扰的靶标,设计4对干扰片段连接至带有GFP和U6 RNA聚合酶启动子的PRNATU6．1载体．将构建好的质粒转染HEK293T细胞,通过RT-PCR和Western blotting的方法分别在RNA和蛋白水平上来检测BACEI和Aβ,以鉴定其干扰效率,并通过夹心ELISA的方法进一步在过表达蛋白APP和BACE1的HEK293T细胞体系中验证干扰质粒对Aβ1-42生成的影响．RT-PCR和Western blotting结果提示β分泌酶的siRNA能干扰BACE1和Aβ RNA和蛋白水平表达,效率分别达到90％和80％．Westem blotting和ELISA结果提示,β分泌酶的siRNA也降低Aβ1-42生成．     

芸薹属类黄酮3'-羟化酶基因家族RNA干扰载体的构建

目的：构建芸薹属类黄酮3′羟化酶（F3′H）基因家族的RNAi载体。方法：采用PCR克隆了607bp的芸薹属F3’H基因家族的RNAi片段,将其反义片段、正义片段分别采用NcoⅠ＋AatⅡ、BamHⅠ＋XbaⅠ插入到改进型植物RNAi基础载体pF-GC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成11366bp的重组载体pFGC5941M-BF3′HI（简称为pBF3′HI）,复合PCR鉴定后转化根癌农杆菌,获得工程菌株。结果：载体构建成功。结论：构建了RNAi载体pBF3′HI,可用于芸薹属植物花色、种皮色泽、茎叶色彩等性状的机理研究和遗传修饰。