siRNA介导多药耐药相关蛋白(MRP1)的表达沉默

利用pSIREN-RetroQ载体构建了3个沉默多药耐药相关蛋白（MRP1）基因表达质粒pSI REN-siRNAs.并通过限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序鉴定,将截断MRP和全长MRP1 cDNA分别克隆到真核表达载体pEGFP-N2和pcDNA3.1中,产生了pEGFP-MRP1T和pcDNA-MRP1表达质粒．质粒pEGFP-MRP1T分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞沉默MRP1T-GFP靶基因,pSIREN-siRNA1作为阴性对照.荧光显微镜下显示结果表明,与pSIREN-siRNA1相比,pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3产生的siRNA能够有效沉默MRP1T-GFP融合蛋白的表达．为了沉默全长MRP1基因的表达,pcDNA-MRP1分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞．Western印迹和MTT分析表明,pSIREN-siRNA2和pSIREN- siRNA3能有效抑制190 kD MRP1在HEK293细胞中的表达,而pSIREN-siRNA1则不能．pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3能逆转MRP1转染HEK293细胞产生的多药耐药性．RNA二级结构预测结果分析表明,siRNA1靶序列mRNA局部自由能热动力参数ΔG低于siRNA2和siRNA3靶序列mRNA局部自由能热动力参数,siRNA1的GC含量和Tm值高于siRNA2和siRNA3．这些数据提示,siRNA和局部靶结构可能影响siRNA对MRP1 mRNA表达的沉默作用．     

β分泌酶1降低β肌养蛋白聚糖的蛋白质水平

目的 β分泌酶1（BACE1）是阿尔茨海默病患者脑中淀粉样蛋白（Aβ）产生的关键酶。肌养蛋白聚糖 （dystroglycan,DG）帮助星形胶质细胞的终足锚定在脑血管上,形成一道支持血脑屏障的胶质界限。一项无靶标蛋白质组学研究指出BACE1可能会下调DG的表达水平。本文旨在研究BACE1能否调控DG的蛋白质水平及其可能的调控机制。方法 利用瞬时转染法在HEK-293T细胞系和原代培养的小鼠星形胶质细胞中表达目的蛋白。通过蛋白质免疫印迹分析目标蛋白质的相对水平。利用基因荧光定量和免疫共沉淀技术探索BACE1调控DG的潜在机制。结果 在HEK-293T和原代小鼠星形胶质细胞中引入BACE1会使DG β亚基（β-DG）的蛋白质水平显著降低。在HEK-293T细胞中,β-DG蛋白水平的下降依赖于BACE1的酶活性。结论 在HEK-293T细胞和小鼠星形胶质细胞中,BACE1使β-DG的蛋白质水平下降。     

人Notch信号通路中Jagged1基因的克隆与真核表达

[目的]克隆人Notch信号通路中配体Jagged1基因并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR的方法从Hela细胞总RNA中获取Jagged1基因,并克隆至携带FLAG标签的真核表达载体pCMV-Tag4。经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒Jagged1-pCMV-Tag4瞬时转染HEK 293T细胞,通过Q-PCR和Western blot检测目的蛋白的表达。[结果]成功构建了真核表达质粒Jagged1-pCMV-Tag4并在HEK 293T细胞中瞬时表达。[结论]Jagged1在HEK 293T细胞中实现瞬时表达,为稳定表达和进一步研究Jagged1/Notch信号通路奠定基础。     

比格犬ERβ1293基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的 观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位.方法 以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长.Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western blotting）和间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况.结果 成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中.Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质.结论 前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的 基因编码蛋白定位在细胞中发生变化.     

RNA干扰抑制TGF-βⅡ型受体的表达

目的:观察针对TGF-βRⅡ的干扰RNA对TGF-βRⅡ表达的抑制作用,探讨RNA干扰TGF-βRⅡ的方法对肾问质纤维化的抑制作用.方法:PCR方法扩增TGF-βRⅡ的cDNA序列,将全长的TGF-βRⅡ cDNA插入pcDNA3中,构建TGF-βRⅡ的真核表达栽体,酶切、测序及间接免疫荧光鉴定;根据TGF-βRⅡ的设计针对TGF-βRⅡ的干扰RNA,构建针对TGF-βRⅡ的RNA干扰质粒pSUPER-TGF-βR Ⅱ并进行酶切及测序鉴定;脂质体介导针对TGF-βR Ⅱ的RNA干扰质粒和TGF-β RⅡ的真核表达载体共转染293T细胞,western-blot检测293细胞内TGF-β R Ⅱ的表达.结果:pcDNA3-TGF-βRⅡ测序结果显示TGF-βRⅡ基因未发生突变.间接免疫荧光检测TGF-βRⅡ在293T细胞内的表达;测序显示RNA干扰质粒pSUPER-TGF-βRⅡ序列正确,RNA干扰质粒明显抑制293T细胞内TGF-βRⅡ的表达.结论:成功构建了TGF-βRⅡ的真核表达载体及针对TGF-βRⅡ的RNA干扰质粒,RNA干扰质粒能够抑制TGF-βRⅡ的表达,为进一步研究针对TGF-βRⅡ的RNA干扰对肾纤维化的预防及治疗作用提供有用工具.     

核转录因子TR3小干扰RNA载体的构建及其效果鉴定

目的：构建核孤儿受体TR3的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并进行沉默效果测定。方法：根据TR3 mRNA序列和载体psiSTRIKE的粘性末端,设计合成TR3的干扰RNA序列,退火后克隆至psiSTRIKE,经测序鉴定后用阳离子脂质体将重组子和TR3高表达载体TR3-pcDNA共转染至HEK293细胞中,以Western blotting检测干扰后HEK293细胞内TR3表达的变化。结果：Western blotting检测结果证实构建的TR3 siRNA表达重组载体可显著抑制HEK293细胞内TR3的高表达。结论：构建了核孤儿受体TR3 siRNA真核表达载体。     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

IFN-λ1在HEK293T细胞中表达纯化及活性检测

[目的]构建IFN-λ1真核表达质粒,利用人胚胎肾HEK293T细胞表达系统,获得具有良好生物学活性的IFN-λ1重组蛋白。[方法]将IFN-λ1目的基因克隆到pcDNA3.1+载体NheⅠ与XhoⅠ多克隆位点构建pcDNA3.1-IFN-λ1分泌表达质粒,并将其转染到HEK293T细胞中;采用Ni-NTA亲和层析方法分离纯化重组蛋白,SDS-PAGE和蛋白免疫印迹(Western Blotting)检测IFN-λ1的表达与纯度;采用qPCR、WB结合显微镜观察检测IFN-λ1的生物学活性。[结果]IFN-λ1真核表达质粒构建正确,而且能够在HEK293T细胞中分泌表达重组蛋白,分离纯化的IFN-λ1能够有效地诱导ISG15、ISG54、ISG56、OAS1、TNFα、MX1和TRAIL等凋亡相关基因的表达,激活p38促凋亡信号通路,抑制水泡性口炎病毒对BHK-21细胞的感染。[结论]成功构建了pcDNA3.1-IFN-λ1真核表达质粒,能够在HEK293T细胞中分泌表达IFN-λ1重组蛋白;分离纯化的IFN-λ1重组蛋白具有潜在的抗肿瘤和抗病毒生物学活性,为进一步研究IFN-λ1的功能和临床应用奠定了基础。     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

重组人CLK1的真核表达及鉴定

目的:合成真核细胞CLK1(Cdc2-like kinase 1)编码基因,构建CLK1/pEGFP-N2真核表达载体并在真核细胞HEK293A中过表达,为CLK1的生物学功能研究奠定基础。方法:从人脐静脉血管内皮细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术用已知引物合成cDNA,将CLK1基因扩增后插入真核细胞表达载体pEGFP-N2,将重组质粒热转化至大肠杆菌感受态Trans 10细胞中获得重组菌株,提取质粒进行酶切鉴定及插入基因测序;将构建的重组质粒转染HEK293A细胞,用Western印迹及免疫荧光检测CLK1的表达水平,同时对其下游的磷酸化SF2/ASF蛋白进行检测。结果:构建了CLK1/pEGFP-N2真核表达载体,将其转染HEK293A细胞后24 h,CLK1蛋白表达水平最高;同时,CLK1过表达后使得下游的SF2/ASF蛋白磷酸化水平升高。结论:构建了人CLK1基因的真核细胞表达载体CLK1/pEGFP-N2,并在HEK293A细胞中过表达,其生物活性也得到了验证。本研究为外源性CLK1基因在真核细胞中过表达提供了一种途径,为CLK1的生物学功能研究奠定了基础,也可为真核细胞其他蛋白表达体系的构建提供借鉴。