我国两株登革2型病毒5′和3′端非编码区序列测定及二级结构分析

为测定我国两株临床症状、乳鼠神经毒力不同的登革 2型病毒流行株 5′和 3′端非编码区序列 (untranslated region,UTR) ,分析二级结构差异与毒力变化的关系 ,分别从 D2 - 0 4、D2 - 44株感染的 C6/ 36细胞及鼠脑中提取总 RNA.以该 RNA为模板 ,利用 RACE法 ,分别扩增了 D2 - 0 4、D2 -44株的 5′和 3′末端 c DNA片段 .将其分别与 p GEM- T载体连接得到重组质粒 ,测定上述 c DNA插入片段的序列 .用 RNAdraw软件预测 D2 - 0 4、D2 - 44株 5′和 3′端非编码区的二级结构 .D2 - 0 4、D2 -44株 5′端和 3′端非编码区分别有 96和 454个核苷酸 .其中 5′非编码区 59位 C(D2 - 0 4 )→T(D2 -44 ) ,使 D2 - 44二级结构稳定性下降 ;3′端非编码区有 1 5个核苷酸不同 ,其中 T(355)→ A,T(32 6)→ G引起了所在位置二级结构自由能变化 ,且分别位于两个保守序列区 (conserved sequence,CS)CS1、CS2 A.这些位点变化可能与毒力有关 .     

茶尺蠖小RNA病毒5′端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique 小RNA病毒(EoPV)中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端.克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征:A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多.利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点(IRES)的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域.据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制.     

森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列测定

为了解森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列与生物特性的关系,从而为疫苗研制打下基础,对其核苷酸序列进行测定。采用RACE法进行RT-PCR扩增,克隆法测序。结果表明：森张株5′-UTR长129nt,与Sofjin-HO、Oshima5-10、Vasilchenko、Neudoerfl、263、Hypr的同源性分别为92％、91％、89％、87％、87％、87％。森张株存在三处特异性变异C18→T、T30→C及49、50连续两个核苷酸缺失。本实验建立了一套相似5′端非编码区序列测定方法;三处特异性变异可能影响到森林脑炎病毒森张株的转录、翻译及核衣壳的形成。     

4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS—CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至Teasy vector。扩增片段的序列测定结果表明：所分离的4株SARS—CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游—197nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

茶尺蠖小RNA病毒5'端非编码区的克隆和测序及与哺乳动物小RNA病毒的比较分析

用Trizol从纯化的茶尺蠖Ectropis oblique小RNA病毒（EoPV）中提取病毒基因组RNA,逆转录后加poly(dT),然后进行两步PCR扩增基因组5′端。克隆测序后,对其5′端非编码区的核苷酸序列进行分析,发现具有哺乳动物小RNA病毒的5′端非编码区的一些特征：A/T含量丰富、起始密码子上游AUG和小顺反子多。利用mfold预测了EoPV 5′端非编码区的二级结构,存在4个茎环结构,有哺乳动物内部核糖体进入位点（IRES）的保守区域,即含保守基序GNRA的茎环A和A/C丰富的环B及多聚嘧啶区域。据此推测EoPV基因组翻译采用IRES起始机制。     

丙型肝炎病毒5′-非编码区及其结合蛋白的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)RNA5′-非编码区(5′-NTR)由341个核苷酸组成,形成4个茎-环二级结构,5′-NTR二级结构及某些部分单链序列的核苷酸组成是病毒翻译起始的先决条件.5′-NTR中的大部分核苷酸序列组成内部核糖体进入位点(IRES),在宿主细胞蛋白质因子La自身抗原、eIF3、多聚嘧啶区结构蛋白(PTB)、多聚胞嘧啶结合蛋白(PCBP-1、2)等的作用下,形成复杂的翻译起始复合物,对HCV的翻译过程进行精确调控,完成帽状结构形成非依赖性的蛋白翻译过程.HCV RNA 5′-NTR翻译过程的分子生物学机制的研究,将有助于HCV治疗新方法和新途径的探索.     

PI3KγmRNA 3′非翻译区可能存在基因表达负调控区

为探索人磷脂酰肌醇 3 激酶γ(phosphoinositide 3 kinasePI3Kγ)基因 3′端非翻译区内AU富含区是否在基因表达调控中起作用 ,首先通过生物信息学分析发现在其 3′端非翻译区 (UTR)内存在0 9kb的AU富含区 ,其中包括 4个AU富含元件 ,以及 1个与众多基因非翻译区高度同源的长 130个碱基的区域 .将AU富含区插入报告基因egfp的下游构建pcDNA3 egfp AUR表达载体 .将表达载体转导NIH 3T3,74 0 2及K5 6 2细胞 ,流式细胞检测egfp的表达情况 .PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区可显著降低egfp的表达 2～ 3倍 (P <0 0 1) .利用放线菌素D阻断RNA转录后 ,Northern印迹分析结果显示egfp AURmRNA较egfpmRNA不稳定 .实验结果提示 ,PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区内可能存在转录后水平的基因表达负调控区 ,该负调控区可在一定程度上加速mRNA的衰变     

大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA2 3′端结构分析

本文利用双脱氧序列分析法对我国大麦条纹花叶病毒新疆株(BSMV-XJ)RNA2 cDNA的3′端进行序列分析,证明XJ株RNA2 3′端239个核苷酸与国外典型株3′端相应部位有高度的序列同源性。通过序列分析及使用寡核苷酸定位裂解法和分子杂交确定,在紧邻239个核苷酸的上游有一个Poly(A)结构,3′终端为一个类tRNA结构,亦与国外典型株相同。经分析认为BSMV-XJ3个基因组RNA具有相同的3′端结构。     

PI3KγmRNA 3′非翻译区可能存在基因表达负调控区

为探索人磷脂酰肌醇 3 激酶γ(phosphoinositide 3 kinasePI3Kγ)基因 3′端非翻译区内AU富含区是否在基因表达调控中起作用 ,首先通过生物信息学分析发现在其 3′端非翻译区 (UTR)内存在0 9kb的AU富含区 ,其中包括 4个AU富含元件 ,以及 1个与众多基因非翻译区高度同源的长 130个碱基的区域 .将AU富含区插入报告基因egfp的下游构建pcDNA3 egfp AUR表达载体 .将表达载体转导NIH 3T3,74 0 2及K5 6 2细胞 ,流式细胞检测egfp的表达情况 .PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区可显著降低egfp的表达 2～ 3倍 (P <0 0 1) .利用放线菌素D阻断RNA转录后 ,Northern印迹分析结果显示egfp AURmRNA较egfpmRNA不稳定 .实验结果提示 ,PI3Kγ基因 3′非翻译区AU富含区内可能存在转录后水平的基因表达负调控区 ,该负调控区可在一定程度上加速mRNA的衰变     

甲型肝炎减毒活疫苗(H2株)快速繁殖株不同代次全基因序列比较

为探索甲型肝炎减毒活疫苗 (H2株 )细胞适应的分子机制 ,将甲型肝炎减毒活疫苗毒株(HAVH2K7)在人胚肺二倍体细胞KMB17上快速连续系列传代增强适应 ,繁殖周期由原来的 2 8d缩短为 14d ,连续传代后抗原滴度和感染性滴度不断增加 ,传至 2 2代抗原滴度达 1∶10 2 4 ,感染性滴度lgCCID50 (每ml)为 7 83 .分别将第 6代和第 2 2代病毒用AC PCR法和PCR法扩增 .扩增片段分别与pGEM T载体连接得到重组质粒 ,测定cDNA插入片段的序列 .对 2个不同代次全基因序列及氨基酸序列比较分析表明 ,HAVH2K7适应至第 6代时 ,整个基因组有 6个核苷酸变异 ,全部位于编码区内 ,变异率为 0 0 7% ,导致 3个氨基酸变化 ,分别位于VP2 (A S) ;2C(N H) ;3A(R C) .适应至第 2 2代时 ,整个基因组出现 18个核苷酸突变 ,变异率为 0 2 4 % ,13个是该代次产生的 ,变异最大区域 5′端非编码区 (5′UTR)有 5个核苷酸变异 .编码区突变导致 7个氨基酸变化 ,其中 4个氨基酸变化是该代次在 6代基础上特有的变异 (2C ,Q P ;3A ,A S ;3C ,T A ;3D ,V G) .2C区是编码区变异最多区域 ,共有 4个核苷酸突变 ,在 6代变异基础上出现 3个新突变 ,导致 1个氨基酸变异 .说明 5′UTR的2C区变异对病毒的翻译效率、感染性滴度提高具有重要作用 .     

Comparison of full-length genomics sequences between dengue virus serotype 3, parental strain,and its derivatives,and B-cell epitopes prediction from envelope region

Biological markers are normally used to evaluate the candidate of live-attenuated dengue vaccines. D3V 16562 Vero 23 and D3V 16562 Vero 33 which were derivatives of D3V 16562, parental strain, showed the similar biological data. We used molecular techniques and computational tools to evaluate these derivatives. The nucleotide and amino acid sequences of the derivatives were compared to their parent. The secondary structures of untranslated regions and B-cell epitopes were predicted. The results showed that nucleotide substitutions mostly occurred in NS5 and NS5 of V2 was unusual because of amino acid change at 3349 (tryptophan →stop codon). The nucleotide substitutions in 5''UTR, prM, E, NS1, NS2A, NS3, and 3''UTR were 4, 1, 2, 2, 1, 3, and 2, respectively. The secondary structure of 5''UTR of V2 was different from P and V1. The secondary structure of 3''UTR of V2 was similar to P and certainly distinct from V1. Furthermore, B-cell epitopes prediction revealed that there were 21 epitopes of envelope and the interesting epitope was at position 297-309 because it was in domain III in which the neutralizing antibody is induced. For this study, the attenuation of derivatives was caused by the nucleotide substitutions in 5''UTR, 3''UTR, and NS5 regions. The genotypic data and B-cell epitope make the derivatives attractive for the chimeric and peptide DENV vaccine development.     

我国登革 4型病毒 B5株基因组全序列的测定及分析(英文)

 对我国登革 4型病毒 B5株 (D4- B5)基因组进行全序列测定及分析 ,为研究病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革疫苗奠定基础 .根据登革 4型病毒 81 4669株的序列设计特异引物 ,通过 RT- PCR扩增出 D4- B5株不同长度的片段 ,分别克隆到 p GEM- T载体 ,将挑取的阳性克隆进行 PCR、酶切鉴定及序列测定 .结果显示 ,D4- B5株的基因组全长 1 0 665nt,5′和 3′非编码区分别为 1 0 1 nt和 40 3nt,中间一个长 1 0 1 61 nt的开放读码框架 ,编码 3387个氨基酸 .与 D4- 81 4669株比较 ,两者核苷酸序列同源性为 93.0 8% ,氨基酸序列同源性为 96.58% .D4- B5株的基因组全序列与 D4- 81 4669株类似 ,但也有较大差异 .同源进化分析表明 ,D4- B5株的基因型为 型 ,与登革 4型病毒菲律宾分离株亲缘关系较近 .这是首次报道的我国登革 4型病毒分离株基因组全序列 ,对研究病毒基因组结构与功能的关系 ,探讨我国毒株的地理来源及研制适合我国人群的新型登革疫苗具有一定的意义 .     

Study on the determinants of suckling mice neurovirulence of dengue 2 virus

Denguevirusescausedenguefever(DF),denguehaemorrhagicfever(DHF)anddengueshocksyndrome(DSS).DFisoneofthemostimportantarthropod-bornehumandiseasesintropicalandsubtropicalareas.Severallarge-scaledenguefeverepidemicsinSouthChinahavetakenplaceinSouthChinaeveryfewyearssince1978andmorethan1000casesofdenguefeverwerereportedinFuzhouofChinainAugust1999[1].However,nodenguevaccinesarecommerciallyavailableatpresent.Onemajordifficultyhinderingthedevelopmentofadenguevaccinehasbeenthelackofasuitableanim…     

Fine‐tuning levels of heterologous gene expression in plants by orthogonal variation of the untranslated regions of a nonreplicating transient expression system

A transient expression system based on a deleted version of Cowpea mosaic virus (CPMV) RNA‐2, termed CPMV‐HT, in which the sequence to be expressed is positioned between a modified 5′ UTR and the 3′ UTR has been successfully used for the plant‐based expression of a wide range of proteins, including heteromultimeric complexes. While previous work has demonstrated that alterations to the sequence of the 5′ UTR can dramatically influence expression levels, the role of the 3′ UTR in enhancing expression has not been determined. In this work, we have examined the effect of different mutations in the 3′UTR of CPMV RNA‐2 on expression levels using the reporter protein GFP encoded by the expression vector, pEAQexpress‐HT‐GFP. The results showed that the presence of a 3′ UTR in the CPMV‐HT system is important for achieving maximal expression levels. Removal of the entire 3′ UTR reduced expression to approximately 30% of that obtained in its presence. It was found that the Y‐shaped secondary structure formed by nucleotides 125–165 of the 3′ UTR plays a key role in its function; mutations that disrupt this Y‐shaped structure have an effect equivalent to the deletion of the entire 3′ UTR. Our results suggest that the Y‐shaped secondary structure acts by enhancing mRNA accumulation rather than by having a direct effect on RNA translation. The work described in this paper shows that the 5′ and 3′ UTRs in CPMV‐HT act orthogonally and that mutations introduced into them allow fine modulation of protein expression levels.