4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS—CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至Teasy vector。扩增片段的序列测定结果表明：所分离的4株SARS—CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游—197nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

黄热病毒的一步RT-PCR法检测

自不同稀释度的乳鼠脑病毒悬液中制备总RNA,在自制缓冲液条件下,进行一步RT-PCR法检测。对一步RT-PCR法与常规RT-PCR的敏感性进行比较,并且以基孔肯亚病毒和登革1-4型病毒RNA为模板进行特异性观察。结果表明,本研究建立的一步RT-PCR法可检出2.8×10~3PFU的病毒,敏感性比常规RT-PCR法高10倍,且与基孔肯亚病毒、登革病毒1-4型无交叉反应,具有良好的特异性和敏感性,适用于黄热病毒的病原学检测。     

森林脑炎研究进展

森林脑炎又名蜱传脑炎(TBE),是由森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)引起,经蜱传播,以中枢神经病变为特征的急性传染病.1910年,在前苏联亚洲部分发现以中枢神经病变为主要特征的急性传染病.1936年,Tkachev氏首次用小白鼠从患者分离到病毒.1937年从当地主要蜱种全沟硬蜱体内分离到同一种病毒,提出并证实蜱为本病传播媒介.1938年证实了森林中的啮齿类动物为本病贮存宿主.第二次世界大战后,欧洲有关本病的报告越来越多,几乎大部分国家均有报告.1990年由Pletnev AG等人首次完成森林脑炎病毒全基因组序列测定.我国于1942年发现该病,1952年从患者及蜱中分离到森林脑炎病毒,近几年流行又有增强趋势[1].     

我国森林脑炎病毒森张株编码区序列测定

为鉴定我国森林脑炎病毒亚型,了解基因组结构与生物功能的关系,同时为森林脑炎病毒新型疫苗研制打下基础,对森林脑炎病毒森张株编码区序列进行测定.根据已发表的Sofjin-HO、Oshima5-10株序列设计9对重叠引物,通过RT-PCR扩增不同的cDNA片段,分别克隆至pGEM(R)-T载体,转化DH5 α菌,挑阳性克隆PCR、酶切鉴定后测序.结果表明森张株编码区全长10 245nt,编码3 414个氨基酸.我国森林脑炎病毒森张株与Oshima5.10、Sofjin-HO、Sofjin同源性最近,属于远东亚型.     

4株SARS冠状病毒基因组5’端序列的分析与比较

利用5′RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5′端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector。扩增片段的序列测定结果表明:所分离的4株SARS-CoV基因组5′端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大。同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5′-CUAAAC-3′。     

森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列测定

为了解森林脑炎病毒森张株5′端非编码区序列与生物特性的关系,从而为疫苗研制打下基础,对其核苷酸序列进行测定。采用RACE法进行RT-PCR扩增,克隆法测序。结果表明：森张株5′-UTR长129nt,与Sofjin-HO、Oshima5-10、Vasilchenko、Neudoerfl、263、Hypr的同源性分别为92％、91％、89％、87％、87％、87％。森张株存在三处特异性变异C18→T、T30→C及49、50连续两个核苷酸缺失。本实验建立了一套相似5′端非编码区序列测定方法;三处特异性变异可能影响到森林脑炎病毒森张株的转录、翻译及核衣壳的形成。     

4株SARS冠状病毒基因组5′端序列的分析与比较

利用5'RACE试剂盒对从中国不同地区、不同SARS患者体中分离的SARS-CoV基因组5'端序列进行RT-PCR扩增,并将扩增产物克隆至T easy vector.扩增片段的序列测定结果表明所分离的4株SARS-CoV基因组5'端非编码区的核苷酸序列和其他国家和地区报道的序列基本一致,而且所形成二级结构也完全相同,但与已知普通冠状病毒的差别较大.同时发现在依赖于RNA的RNA聚合酶起始密码子上游-197 nt处有冠状病毒典型的转录调控核心保守序列5'-CUAAAC-3'.     

五种虫媒病毒的细胞敏感性观察

对新引进 5种虫媒病毒 :马雅罗病毒 (MAY) ,西门利克病毒 (SFV) ,墨累谷脑炎病毒 (MVE) ,伊利乌斯病毒 (ILH)和布尼安姆韦拉病毒 (BUN)采取乳鼠脑内接种的方法传出 ;选择BHK2 1、LLC MK2 、A549和C6 / 36传代细胞 ,进行这 5种病毒的敏感性试验 ,观察病毒在细胞上的CPE出现时间、特点以及滴度。实验表明 ,BHK2 1细胞对 5种病毒CPE特征明显 ,出现时间较早 ,滴度较高 ,适用于 5种病毒的组织培养。     

我国登革2/4型病毒株Pr-M-E基因的双表达质粒构建及在真核细胞中的共表达

将我国登革 2、4型病毒分离株PrM E基因通过RT PCR以病毒RNA为模板扩增我国登革 2型 4 3株和 4型B5株的PrM E基因 .并分别克隆至pGEM TEasy载体 ,然后亚克隆至双顺反子表达质粒的两个多克隆位点 ,获得同时含有登革 2型 4 3株和 4型B5株PrM E基因的双顺反子重组表达质粒pIDME2 4 .在用该重组质粒转染的BHK2 1细胞中 ,不但可检测到PrM E基因的转录产物 ,而且采用间接免疫荧光法还可观察到针对登革 2型 4型病毒的特异荧光 .研究结果表明 ,重组的双顺反子表达质粒在真核细胞中可共表达登革两个血清型PrM E基因 ,为双价登革核酸疫苗的研究奠定基础     

4株SARS冠状病毒中国分离株3′非编码区的序列测定及分析

分别对 4株SARS冠状病毒中国株基因组 3′非编码区序列进行测定和分析 ,然后应用Blast、DNAstarGeneQuest等软件对中国株的这段序列与其它SARS和非SARS冠状病毒的序列进行比较 .结果显示 ,所测 4株SARS冠状病毒中国分离株的 3′非编码区长度均为 339nt,与其它已测序SARS冠状病毒的相应序列完全一致 .SARS冠状病毒的非编码区含有冠状病毒保守的“伪结”结构 .在距末端 138nt处还存在 1个长约 32nt的Ⅱ型茎 环结构的序列 ,该序列在其它已知人冠状病毒中并不存在 ,而与禽传染性支气管炎病毒和星状病毒中的对应序列高度同源 .