固相人工合成睡眠肽的δ和σ活动增强作用的研究

从山羊、大白鼠和兔等动物的脑中曾提取睡眠促进物质,但直到目前为止,仅DSIP 是唯一被搞清楚具体化学结构的睡眠促进物质。本文报告了静脉注射(25μg/kg)或脑室注射(5μg/兔)(5μg/25μl/6min)固相合成的DSIP 能引起兔脑的δ和σ活动的增强作用,并初步发现[Phe~5]-DSIP 也能在兔脑引起δ和σ活动的增强作用。     

人工合成睡眠肽〔Asp~5〕-α-DSIP生理效应的研究

Sckonenberger and Monnier 首先报道了人工合成“δ—睡眠促进物质”(DSIP),后来发现是20% 5-位天门冬氨酸α—DSIP 和80% 5-位天门冬氨酸β-DSIP 的混合多肽。由于脑内天然提取的 DSIP 被认为是纯5-位天门冬氨酸α-DSIP([Asp~5]-α-DSIP),因此季爱雪、刘世熠等致力于[Asp~5]-α-DSIP 的人工合成及其生理活性的探讨。本文揭示了[Asp~5]-α-DSIP具有下述生理特性:(1)第三脑室注射途径较敏感,约5μg/兔的剂量就能引起脑电δ和σ活动的增强。(2)第三脑室注射较大剂量(100μg/兔)时,δ和σ活动的增强作用反而不够明显。(3)连续6天静脉注射(50μg/kg)未出现明显的适应性,同时表明该睡眠多肽能通过家兔的血脑屏障。     

睡眠物质的近代研究

已从剥夺睡眠的兔、山羊、大白鼠等动物的脑脊液、脑组织,甚至人类脑脊液或尿液中提取出多种内源性促睡眠物质,包括 DSIP,S 因子(或 SPU),SPS,前列腺素 D_2,γ-Br,褪黑素,精氨酸催产素(AVT)等。它们具有明显的促进慢波睡眠和/或异相睡眠的作用,但作用快慢、强弱及持续时间不尽相同。     

PHLD融合蛋白在毕赤酵母中的构建和表达

δ-睡眠肽(delta sleep inducing peptide, DSIP)的相对分子质量较小,在体内半衰期较短,因此本研究将蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)、人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)、连接肽(linker)以及δ-睡眠肽(DSIP)进行融合表达,以获得重组PHLD睡眠肽融合蛋白。研究以pPIC9K/HSA为模板,利用PCR技术进行扩增,将获得的PHLD基因连接到表达载体pPIC9K上,然后转入组氨酸缺陷型毕赤酵母GS115,经G418筛选获得了高表达PHLD融合蛋白的酵母工程菌株,并进一步获得了高纯度的融合蛋白。本研究将为DSIP的深入研究和应用提供技术资料。     

睡眠发生的机制

睡眠具有不同的时相,由慢波睡眠和异相睡眠(REM睡眠)组成,慢波睡眠使机体达到充分的休息,REM睡眠是活动相。近年从剥夺睡眠的兔、山羊、鼠等动物的脑脊液、脑组织及人的脑脊液、尿液中提取出多种内源性睡眠物质,包括DSIP、S因子、SPU、SPS、PGD_2、V—B_r、褪黑素和ANT等。睡眠发生的机制有多种假说,本文对各种假说进行了阐述,并提出了自己的看法。     

猫延髓背部微量注射纳洛酮对电针增强胃运动效应的影响

利用应变规记录33只急性猫的胃窦部蠕动,同时用双极电极记录其胃电。结果发现,微量注射吗啡(10μg/2μl)于低位延髓背部或电针双侧“足三里”都能引起胃窦部蠕动增强(P<0.01)和部分动物簇状锋电位发放。如果事先向低位延髓背部微量注射纳洛酮(2μg/5μl),则电针“足三里”的增强胃窦部蠕动的效应就不再出现。这些结果提示电针“足三里”引起的胃窦部蠕动增强与脑内阿片样物质释放,及其作用于低位延髓背部的一些神经结构有关。     

头端延髓腹外侧区注射5-羟色胺对应激性高血粘度及血压升高的影响

实验用Wistar大鼠62只,采用束缚加悬吊的方法引起应激性高血粘度和血压升高。结果观察到,清醒大鼠束缚加悬吊二天可引起应激性高血粘度和血压升高。第四脑室内注射5-羟色胺(5-HT25μg/10μl)或在双侧延髓腹外侧区头端(rVLM)微量注射5-HT(4μg/0.5μl/每侧)均可抑制应激性高血粘度和血压升高,若预先在双侧rVLM微量注射5-HT受体阻断剂肉桂硫胺(4μg/0.5μl/每侧)后再在第四脑室或延髓腹外侧区内注入上述同剂量的5-MT,则5-HT降低应激性高血粘度和血压升高的作用消失。看来上述5-HT的作用是通过rVLM内5-HT受体的激活来实现的。     

侧脑室内注射微量五肽胃泌素对大鼠胃肠推进运动的影响

以炭粉混悬液在大鼠小肠内推进距离占小肠全长的百分数,作为胃肠推进运动的指标,观察了侧脑室内注射微量五肽胃泌素(G_5)对这一推进运动的影响。结果如下:(1)侧脑室内(ICV)注射c_5(1μg/10μl、2μg/10μl 或4μg/10μl)可显著增强胃肠推进运动(P<0.01—0.001)。切断两侧膈下迷走神经、阿托品皮下(0.2mg/kg)或侧脑室内(5μg/10μl)注射均可完全阻断这一增强效应(P<0.001)。(2)肌注较大剂量G_5(20μg/100g)可显著增强胃肠推进运动(P<0.001),这一效应亦可为皮下注射阿托品(0.2mg/kg)所完全阻断(P<0.001)。(3)酚妥拉明(2.5mg/kg im或50g/10μl ICV)或心得安(5mg/kgim或50μg/50μl ICV)对侧脑室内注射G_5增强胃肠推进运动的作用均无影响(P>0.05)。上述结果表明侧脑室内注射G_5后,可能激活中枢胆硷能系统,通过迷走神经而使胃肠推进运动增强。     

内源性催眠因子

自1910～1913年间,Legendre和Piéron报告了在剥夺睡眠狗的血液、脑和脑脊液中可能存在某种具有催眠作用的物质后,许多工作者相继对这种物质进行了大量的研究,这些工作从不同的动物、不同的组织中成功地得到了多种具有催眠作用的活性物质。 Monnier及其同工刺激家兔丘脑的睡眠区使其入睡,然后对它们的血液进行透析,得到了一个分子量849的九肽,命名δ睡眠肽(DSIP)。随着放射免疫方法的发展,这种肽又先后在人的血液、大鼠的丘脑和松果腺中被测到。Pappenheimer等从剥夺睡眠的山羊脑和脑脊液中获得了“S因子”,将这种因子给大鼠和家兔作脑室灌流可增加慢波睡眠(SWS),进一步的工作证明了这是一种分子量350～500的多肽。Yanagisawa等从人的脑脊液中分离到一种2-辛基-γ-溴乙酰乙酸盐,给猫静脉注射可引起快波睡眠(PS)。Inoué等从剥夺睡眠的大鼠脑干中提取到一种含有两个以上活性片段的多肽,可以增加大鼠与小鼠的SWS和PS,     

脑室注射P物质对大鼠血压、心率及交感传出活动的影响

给乌拉坦麻醉六鼠侧脑室注射P物质(SP)10μg,引起动脉血压、心率和内脏交感神经放电增加。同样剂量的SP静脉注射后却引起血压降低。阿托品预处理不影响SP的开心率作用。预先脑室注射0.25,4,64μg阿片受体拮抗剂纳洛酮,对SP的升压效应有剂量依赖式对抗作用。以上说明脑室注射SP 引起的血压升高是交感神经活动增强,导致心率加快及外周血管紧张性增加的结果,并提示SP的中枢升压效应可能与脑内释放内源性阿片样物质有关。     

刺激大鼠迷走神经向中端对其不同脑区5-HT含量的影响

采用荧光分光光度法,测定脑内5-HT的含量,观察电刺激两侧颈迷走神经向中端对大鼠海马、下丘脑和中-桥脑内5-HT含量的影响,结果如下:(1)刺激迷走神经向中端后,三脑区的5-HT含量均显著增加(P<0.05-0.005);(2)侧脑室内注射新斯的明(10μg/10μl)或烟碱(10μg/10μl)后,刺激迷走神经向中端使三脑区5-HT含量增多的效应显著提高(p<0.01-0.001);(3)侧脑室内注射六烃季胺(250μg/10μl)后,刺激迷走神经向中端使三脑区5-HT含量增多的效应显著下降(p<0.05-0.005);(4)侧脑室内注射阿托品(10μg/10μl)或纳洛酮(10μg/10μl)后,不影响刺激迷走神经向中端引起的三脑区5-HT含量增多的效应(p>0.05)。由此看来,迷走传入冲动很可能先使脑内Ach释放增多,然后,Ach作用于N-胆碱受体而导致海马、下丘脑和中-桥脑内5-HT含量增加。以上结果表明,在脑内,迷走传入纤维和5-HT能神经元之间可能存在着机能联系。     

RNA聚合酶σ^38亚基缺失对假单胞菌抗生物质合成代谢的影响

设计引物从假单胞菌M18基因组DNA中扩增并获得rpoS基因的378bp保守区段。以此为探针,从假单胞菌基因组文库中克隆了包括rpoS基因全序列及其相邻序列的3·1kbEcoRⅠ-XhoⅠ片段。通过抗性基因(抗庆大霉素基因)的定点插入构建了σ38亚基缺失突变株M18S。HPLC检测结果显示,σ38亚基缺失引起该菌株的抗生物质合成代谢的显著变化。与野生株相比,缺失突变株的吩嗪-1-羧酸在PPM和KMB中2种培养基中合成量由58μg/mL和10·2μg/mL分别减少到20·4μg/mL和0μg/mL;而缺失突变株的藤黄绿脓菌素则相反,在PPM和KMB两种培养基中合成量由0·5μg/mL和20·5μg/mL分别提高到75·4μg/mL和185·6μg/mL。表明σ38亚基可区别性调控假单胞菌M18的抗生物质合成代谢。rpoS基因的互补实验和两种抗生素基因与β-半乳糖苷酶基因的翻译融合表达实验进一步验证了上述的结果:σ38亚基正调控吩嗪-1-羧酸的表达,而负调控藤黄绿脓菌素的表达。     

脑源性神经营养因子拮抗β淀粉样蛋白所致大鼠在体海马长时程增强的伤害

目的:探讨脑源性神经营养因子(BDNF)对β淀粉样蛋白(Aβ)致大鼠突触功能障碍的保护作用。方法:36只健康雄性SD大鼠随机分为对照、Aβ25-35、BDNF、不同剂量BDNF(0.02μg,0.1μg,0.5μg)+Aβ25-35等六组(n=6)。实验采用电生理学手段,利用自制的海马给药装置和刺激/记录绑定电极引导和记录大鼠在体海马CA1区场兴奋性突触后电位(fEPSPs)和高频刺激(HFS)诱导的长时程增强(LTP)。结果:①海马CA1区注射Aβ25-35(2 nmol)不影响基础性fEPSPs,但能显著抑制LTP的诱导与维持,HFS后fEPSPs平均幅度较对照组明显降低(P<0.01);②海马CA1区注射BDNF(0.1μg)不影响基础性fEPSPs,也不影响LTP的诱导与维持,HFS后fEPSPs平均幅度与对照组相比没有明显差异(P>0.05);③与单独给予Aβ25-35相比,不同浓度的BDNF(0.1μg,0.5μg)与Aβ25-35合用组在HFS后0 min、30 min和60 min时的fEPSPs平均幅度均明显增加(P<0.01),并具有一定的剂量依赖性,表明BDNF预处理可有效拮抗Aβ25-35引起的LTP抑制。结论:脑内注射BDNF能够预防和拮抗由Aβ25-35引起的海马LTP损伤,提示BDNF水平的上调有助于维持正常的突触可塑性并可能改善AD患者的学习记忆功能。     

脑啡肽在豚鼠、兔回肠环肌收缩中的作用

豚鼠、兔回肠的未分离环肌,在电场刺激下,可发生缓慢的节律性收缩。此收缩可被纳洛酮完全消除,或被阿托品部分减弱。与此相反,亮脑啡肽和乙酰胆碱司使节律性收缩明显增强。此外,单独用乙酰胆碱(4.3—5.7μg/ml)或亮脑啡(1.4—2.8μg/ml)作用于分离环肌时,均未能使其发生任何收缩反应。但在乙酰胆碱4.3μg/ml作用的基础上,仅用1.4μg/ml的亮脑啡肽,或再用电场刺激时,则均能使其发生明显的收缩。上述结果提示,环肌的收缩可能需要脑啡肽和乙酰胆碱共同作用。本实验的结果还表明,脑啡肽对环肌收缩的作用与对纵肌相反,它使前者兴奋,使后者抑制。     

八肽胆囊收缩素对抗阿片肽的中枢性降血压作用

过去的工作已经证明八肽胆囊收缩素(CCK-8)能够对抗阿片肽的镇痛作用,本工作探讨CCK-8是否能够对抗阿片肽的心血管抑制作用。给戊巴比妥钠麻醉大鼠脊髓蛛网膜下腔(ith)注射 CCK-8可以对抗 ith 注射 mu(μ)型阿片受体激动剂[NMePhe~3,D-Pro~4]Morphiceptin(PL017)(5μg)、delta(δ)型受体激动剂[D-Ala~2,D-Leu~5]Enkephalin(DADLE)(25μg)和 Kappa(K)型受体激动剂[N-Me Tyr,N-Me Arg~7,D-Leu~8]Dynorphin 1-8 ethyla-mide(66A-078)(1μg)引起的降低血压和减慢心率作用。在 MAP 的表现上,CCK-8的拮抗作用(10μg及以下剂量)具有量-效关系,并可被 CCK 受体阻断剂丙谷胺(Proglumide)(100μg)翻转。在 HR 的表现上,上述剂量的 CCK-8也显示了一定的拮抗作用,但量-效关系不如 MAP 表现得明显。单纯将 CCK-8或 Proglumide ith 注射,可见大剂量(50μg)CCK-8可以引起明显的降血压作用和短时的降心率作用,小剂量(0.05μg)CCK-8则表现出明显的降心率作用;ith 注射 Proglumide 100μg,30 min 后也表现出减慢心率的作用。以上结果提示:在脊髓水平,一定剂量范围内的 CCK-8能够对抗阿片肽的心血管抑制效应,此对抗作用是通过 CCK 受体实现的。本工作的结果支持关于 CCK-8是一种抗阿片物质的设想。     

巨噬细胞RNA合成的某些特点

在低浓度(≤1μg/ml)放线菌素D作用下,兔腹腔巨噬细胞RNA合成被抑制的情况与兔肾细胞类似。但随着放线菌素D浓度增高,反而促进巨噬细胞的RNA合成。在浓度为100μg/ml时,可使~3H-尿苷的掺入量比对照增加2—10倍。相反,在此浓度下,兔肾细胞的RNA合成却完全被抑制。蔗糖的存在能使巨噬细胞丧失对放线菌素D这种刺激作用反应的能力,其RNA合成完全被抑制。另一方面,巨噬细胞的KNA聚合酶对利福平的敏感性要比其他非免疫细胞至少高4—5倍。如果用高浓度的(500μg/ml)利福平完全抑制巨噬细胞的转录之后,再     

下丘脑微量注射去甲肾上腺素增强电针镇痛作用的受体分析

向大鼠下丘脑腹内侧核区注射 NA 3μg/3μl 3小时后,电针镇痛的作用约增强6倍,持续长达24小时。此增强效应可被α-阻滞剂酚苄明(25μg/100μl)完全取消,但β-阻滞剂心得安(12.5μg/50μl)对它却无影响。这提示此增强作用通过α-受体而实现,与β-受体无关。又基于α_2-受体激动剂氯压啶的增强效应甚弱,α_2-阻滞剂育享平拮抗 NA 的增强作用弱于酚苄明,由此推论对电针效应的增强作用主要通过α_1-受体(即突触后受体)。纳络酮能拮抗大部分的增强效应,所以阿片受体也参与该增强作用。     

不同阿片受体的特异性激活对黄体生成素和催乳素分泌的影响有差异

Leadem 等分别用μ,δ和κ三种阿片受体不同浓度的激动剂灌流去卵巢大鼠的第三脑室,结果发现:μ受体的激动剂 DAGO[Tyr-D-ALa-Gly-(Me)Phe-Glyol]在浓度为1μg/h 和10μg/h 时明显抑制黄体生成素(LH)的分泌作用;而对催乳素(PRL)的释放有显著加强作用。δ受体激动剂 DPDPE(D-Pen~2,     

家兔孤束核区微量注射羟基马桑毒素对膈神经放电的影响

实验在44只乌拉坦麻醉、肌肉麻痹、切断双侧颈迷走神经的日本大耳白兔上进行。于一侧孤束核区微量注射不同浓度(0.1μg/μl,1μg/μl,5μg/μl,10μg/μl)的羟基马桑毒素1μl,可以引起膈神经放电活动产生可逆的吸气时程和呼气时程缩短,呼吸频率加快及膈神经放电积分的峰幅度降低。羟基马桑毒素0.1μg/μl组作用最弱,1μl/μl组作用最强。5μg/μl组,10μg/μl组还可使膈神经放电活动在呼气期出现短时的吸气性放电及呼气期间歇性不规则延长等呼吸节律紊乱现象。出现上述现象时血压、心率无明显变化,脑电图也未出现异常改变。结果提示:家兔孤束核区参与呼吸时相的转换,而羟基马桑毒素可能作用于孤束核区的呼吸时相转换机制,促进呼吸时相的转换。     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。