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相似文献
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1.
大豆花叶病毒(SMV)在大豆(Gklycine max L.)上引起严重病害。利用RT-PCR扩增并克隆了SMV-ZK(一个中国SMV分离株)基因组中全部蛋白质编码区的dDNA,通过对HC-PRO,NIb和CP编码区进行序列测定与分析,发现SMV-ZK与MSV-G2高度同源,从而在分子水平上证明在我国大豆作物中存在SMV-G2类似株系。  相似文献   

2.
为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶(SjGST)基因工程重组蛋白,以日本血吸虫(中国大陆株)cDNA为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,RT-PCR法扩增GST编码基因序列,将扩增产物连接pGEM-T克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒pBK-CMV中,转染大肠杆菌XL1-blue,经IPTG诱导后用SDS-PAGE分析表达效果。结果 RT-PCR法特异性扩增出日本血吸虫GST编码区基因片段,其  相似文献   

3.
中国人白细胞介素-12 cDNA基因的克隆及序列分析与比较   总被引:3,自引:0,他引:3  
焦宏远  詹美云 《病毒学报》2000,16(4):336-340
为研究中国人IL-12的基因特征,采用逆转录巢式聚合酶链反应(RT-nPCR)从中国人脐带血单核细胞中分别克隆了P35、P40两亚基cDNA基因,包括完整的前体蛋白编码序列,其中P35 cDNA编码219个氨基酸的多肽,P40 cDNA编码328个氨基酸的多肽,与国外序列(NKSF、CLMF)比较结果发现:所克隆序列P35同NKSF相比,第44aa密友子由GTC(Val)→GTG(Val),但未改  相似文献   

4.
核酸酶保护试验在黄瓜花叶病毒株系鉴定中的初步应用   总被引:3,自引:0,他引:3  
采用黄瓜花叶病毒(CMV)亚组Ⅰ株系Fny-CMVRNA_2的1209~1626核苷酸片段和亚组Ⅱ株系Ls-CMVRNA_2的2002~2433核苷酸片段的cDNA克隆,体外转录,同时掺入 ̄(32)P获得负链RNA探针,与纯化的番茄和甜椒上的CMV中国分离物的RNA杂交,结果表明:CMV番茄和甜椒中国分离物与Fny-CMV的核苷酸有高度同源性,隶属于Fny-CMV为代表的亚组Ⅰ株系。并利用K-CMV株系(亚组Ⅰ,源于中国)的RNA_2全长cDNA克隆的两个EcoRI位点间的核苷酸序列(1657~2125nt)作探针,与上述两种CMV中国分离物的RNA杂交,进一步比较分析了这两个分离物和K-CMV株系的关系。讨论了核酸酶保护法在CMV株系鉴定中的作用。  相似文献   

5.
根据已报道的番茄花叶病毒L株系(ToMVL)序列人工合成引物,经RTPCR扩增并克隆了我国番茄花叶病毒分离物(ToMVS1)的外壳蛋白CP基因及3′端非编码区。序列测定结果表明,所得cDNA共长682个核苷酸,其中CP基因含480个核苷酸,编码158个氨基酸,3′端非编码区含202个核苷酸,其核苷酸序列与ToMVL株系具有99.5%的同源率。将该基因片段克隆到pGEMEX1载体中,转入E.coli后诱导表达,经Westernblot检测证明,该基因已在大肠杆菌中正确表达。这是我国首次报道ToMVCP基因序列。  相似文献   

6.
用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因   总被引:2,自引:0,他引:2  
用PCR技术,从GA株马立克氏病病毒(MDV)感染的成纤维细胞(GEF)基因组DNA中扩增出MDV糖蛋白D(gD)抗原基因片段的约1300bp编码序列,将该pcR扩增的产物于EcoRI和Kpnl位点克隆到pUC18质粒载体中,在以digoxigenin(dig)标记的gDPCR产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含MDVgD基因的重组质粒p18MgD。将p18MgD质粒DNA用dig标记后,在Southernblot中,该探针能识别MDV基因组DNA的BamHI-A克隆中的A片段DNA。酶切位点分析表明,该gD克隆也和已发表的MDV的RBIB株gD一样,不含有EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ、SmaⅠ、pvuⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是MDVgD克隆。  相似文献   

7.
以采自河南的真菌传小麦花叶病毒(FWMV-C)为材料,抽提病毒RNA,合成互补DNA(cDNA)。对杂交筛选所得cDNA克隆进行亚克隆及序列分析,结果表明,亚克隆pGSI含有一个长度为891个核苷酸的不完整开放阅读框架(ORF)和长度为258个核苷酸的3'末端非编码区(NTR),并带有Poly(A)尾序。此段序列与大麦黄花叶病毒(BaYMV)及法国报道的一种小麦梭条花叶病毒(WSSMV-F)的RNA-13'末端分别具有67.6%和69.9%的同源性。由所测序列编码区(1-891nt)可推导产生296个氢基酸,并与WSSMV-F及BaYMV外壳蛋白氨基酸序列分别具有75.9%和71%的同源性。此结果表明,FWMV-C为另外一种不同于WSSMV-F的大麦黄花叶病毒组(Baymovirus)病毒,所测基因组片段应为RNA-13'末端序列,其中可能包括了病毒全长外壳蛋白编码区域。  相似文献   

8.
重组人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与测序   总被引:27,自引:0,他引:27  
蛋白激酶CK2是一种存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.它是由两个催化亚基(α或α′)和两个调节亚基(β)组成的不均一四聚体.用反转录PCR从HL-60细胞中获得了人蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA,将NdeⅠ/HindⅢ双酶切PCR产物连接到表达载体pT7-7的NdeⅠ/HindⅢ双酶切位点中.转化感受态细菌DH5α获得转化子,阳性筛选率为72%.限制性酶切分析结果表明,插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符.随机挑选4个阳性质粒测定其插入片段DNA序列,结果显示有2个含有正确插入的人蛋白激酶CK2βcDNA,命名为pTCKB.其余2个克隆分别存在1个和2个点突变,即在其编码区condon148的TCA→TTA,结果Ser→Leu;另一个则在Condon143GTG→ATG,Val→Met;Condon170GTG→GCG,Val→Ala.重组质粒(pTCKB)克隆的成功,将为在原核细胞中表达蛋白激酶CK2β亚基以及利用CK2βcDNA作为探针进行深入研究打下基础.并为利用pT7-7表达载体构建其他重组质粒建立了一套成功的方法  相似文献   

9.
杨永平  江永珍 《病毒学报》1994,10(3):229-234
通过逆转录-聚合酶链式反应,从中国人丙型肝炎病毒携带者的血清中扩增并克隆到2段cDNA片段,即HCV基因组C区抗原基因C831cDNA片断和NS3区抗原基因C33cDNA片段同C831cDNA片段经连接肽Ser-Pro-Gly-Ser连接成为基因嵌合体C33cDNA片段同C831cDNA片段经连接肽Ser-Pro-Gly-Ser连接成为基因嵌合体C33c-C831.C33c-C831基因嵌合体同温  相似文献   

10.
鲤鱼(Cyprinus carpio)生长激素基因克隆及原核表达   总被引:16,自引:0,他引:16  
采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从鲤鱼脑垂体总RNA中扩增出编码鲤鱼生长激素(GH)成熟肽基因序列.定向克隆至质粒pUC18,克隆的鲤鱼GHcDNA不含信号肽序列并以新的起始密码子ATG取代鲤鱼GHcDNA第1个密码子TCA.序列分析表明,与Koren报道的鲤鱼GHcDNA相比有两个碱基差异,但推断的氨基酸序列完全一致.将鲤鱼GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建成重组鲤鱼GH基因表达载体pBVcGH8.SDS-PAGE和薄层扫描分析表明:经42℃诱导,pBVcGH8在大肠杆菌中可表达一分子量约22000的特异蛋白,表达量占细胞总蛋白的29.2%.该基因重组的鲤鱼GH添加到饲料中投喂罗非鱼,证实有明显的促进生长作用  相似文献   

11.
用PCR 方法从丙型肝炎病毒(HCV) cDNA 文库中克隆了两段DNA 片段,即HCV 基因组非结构NS3区抗原基因(约0.7 kb)和核心抗原C区抗原基因(约0.6 kb)的cDNA 片段。在两段cDNA 间加入连接肽Ser- Pro- Gly- Ser 的密码子序列,构建成融合抗原基因NS3- C。将该融合基因与衣藻叶绿体基因atpA 的启动子和rbcL 基因的3′末端连接,得到丙肝病毒融合抗原基因NS3- C表达盒,再将该表达盒与选择标记基因aadA 表达盒和衣藻叶绿体基因组同源片段连接,构建成衣藻叶绿体转化载体pSS6。基因枪法转化衣藻叶绿体,经壮观霉素筛选获得转化再生的单藻落,对转基因衣藻的PCR 和Southern 杂交分析表明,融合抗原基因NS3- C已整合到衣藻叶绿体基因组中。  相似文献   

12.
野生大豆与栽培大豆rDNA ITS1区的研究   总被引:9,自引:0,他引:9  
采用PCR 技术从野生大豆(Glycine soja)、半野生大豆(G.gracillis)、多年生野生大豆(G.tomentella、G.tabacina)和栽培大豆(G.m ax)的两个品种UNION、文丰7 中扩增和克隆了rDNA第一转录间隔区(ITS1)。其在G.m ax 基因组中的拷贝数约为2×103。序列分析表明G.soja、G.gracillis、G.m ax 中的G/C含量为61.40% ,而G.tabacina和G.tom entella的G/C含量分别为58.11% 和59.01% ,与绿豆G/C含量(59.81% )相近。G.tabacina的G/C含量是已知的植物中ITS1 最低的。最大同源性分析表明,大豆属植物ITS1 的同源程度很高,同其近缘属绿豆的同源性明显高于其它作物。同时分析了栽培、多年生和一年生野生大豆间的亲缘关系。另外还发现在已知的植物ITS1 序列中均含有GACCCGCGAA 及GCGCCAAGGAA 两个区段  相似文献   

13.
日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
研究了外源基因日本血吸虫26kD抗原(Sj26GST)在卡介苗(bacilusCalmete-Guerin,BCG)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)和大肠杆菌(E.coli)中的表达.运用重组DNA和聚合酶链反应(PCR)等分子生物学技术,以表达Sj26GST的E.colipGEX衍生质粒为模板,经PCR得到编码Sj26GST的全长cDNA片段.将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)70的启动子下游,再将HSP70启动子和Sj26GST基因一起亚克隆到E.coli-分枝杆菌穿梭质粒pBCG-2000中,得到E.coli-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG-Sj26.pBCG-Sj26电转化入BCG和M.smegmatismc2155中表达Sj26GST抗原,所表达的天然重组Sj26GST(rSj26GST)为可溶性蛋白,在SDS-PAGE上分子量为26kD处可见明显的表达蛋白带.其表达量分别占BCG和M.smegmatis菌体总蛋白的15%和10%.可见,Sj26GST基因能在BCG中高效表达.  相似文献   

14.
用逆转录病毒载体表达人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子   总被引:2,自引:1,他引:1  
陈庆华  张智清 《病毒学报》1995,11(2):138-143
应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒(CMV)启动子的基因片段和人粒细胞-茂噬细胞集落刺激因子(hGM-GSF)的cDNA,克隆进逆转录病毒载体N2A,得到重组质粒N2QA/CMV/hGM-CSF。经脂质体包装并转染包装细胞,通过G418药物筛选,得到抗生克隆。经PCR和Southern blot检测证实,GM-CSF基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达10^4CFU/ml,克  相似文献   

15.
通过逆转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR),从中国人丙型肝炎病毒(HCV)携带者的血清中扩增并克隆到2段cDNA片段,即HCV基因组C区抗原基因C831cDNA片断(约530bp)和NS3区抗原基因C33ccDNA片段(约860bp)。C33ccDNA片段同C831cDNA片段经连接   肽Ser-Pro-Gly-Ser连接成为基因嵌合体C33c-C831(约1400bp)。C33c-C831基因嵌合体同温控型原核表达载体pBV220重组,构建成表达质粒pBV/C33c-C831,并在大肠杆菌细胞中获得了重组嵌合抗原C33c-CL的表达。通过酶切分析和Western免疫印迹法,对约占菌体可溶性蛋白9%的表达产物做了鉴定。采用TritonX-100和盐析处理,获得粗提表达产物。粗提的表达产物经尿素裂解和离子交换层析纯化,得到可用于检测抗HCV核壳蛋白和抗NS3区抗体的重组嵌合抗原C33c-CL。对C33c-CL做抗原性分析发现,它同时具有完整的C33c抗原和C22抗原的免疫反应活性,完全能替代单纯的C33c和C22抗原。该嵌合抗原在血清学诊断中有重要的应用价值,可望成为新一代HCVEIA诊断试剂的优选抗原。  相似文献   

16.
通过有机试剂抽提,CF-11纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株(RiceRaggedStuntVirus,Philippineisolate,简称RRSV-P)的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Segment1到Segment10(S1-S10)的10条双链RNA(dsRNA),然后设计合适的引物,用RT-PCR方法得到S9的cDNA并将其克隆到pUC119质粒上扩增,以双链测序法测定该cDNA的全序列。同时又将此cDNA克隆到大肠杆菌表达质粒pGEX-3X上,在大肠杆菌菌株DE3中用IPTG诱导表达,经超声波破菌、离心、Glutathione-sepharose4B亲和层析,得到纯化的分子量为64kD的融合蛋白。  相似文献   

17.
用电泳迁移分析方法研究了21nt脱氧寡核苷酸G3TG2TGT2G5TG2TGT(CP1)与129bp的乙肝病毒(HBV)核衣壳启动子(Cp)片段内一位点结合形成的三链DNA的特异性及稳定性.在克隆有HBV基因组的质粒pCP10的酶切产物中,CP1仅与含Cp的129bp片段结合.在20mmol/LMg2+溶液中其解离常数(Kd)为1.4×10-7mol/L.不同离子稳定三链DNA的效果依次为sp4+(精胺)>Mg2+>Zn2+>Na+>K+,离子之间存在相互竞争作用.比CP1多一误配碱基的脱氧寡核苷酸G2TG2TGTG3TG2TG2TG2T(CP2)在20mmol/LMg2+溶液中与Cp结合的Kd值约为CP1的1/7,而在60mmol/LK+或5mmol/LZn2+溶液中检测不到它与Cp的结合,这进一步显示了三链DNA形成的特异性.细胞的生理离子浓度被认为是:Sp4+1mmol/L,Mg2+10mmol/L,K+140mmol/L,因此,CP1在细胞内将能特异地与Cp结合并具有较好的稳定性.  相似文献   

18.
CD40配体(CD40L)是TNF超家族成员,表达于人活化的CD4^+T细胞表面,与存在于B细胞、抗原递呈细胞表面的相就受体CD40分子相互作用,促发并调节机体的体液免疫和细胞免疫应答。用PCR法从CD40L全长cDNA质粒中扩增CD40L胞外段编码cDNA,即可溶性CD40L(sCD40L)编码cDNA,并克隆入pSK质粒;cDNA序列经测序证实后与pPICZαA质粒重组构建成pPICZαA-s  相似文献   

19.
利用HSV—TK基因治疗肝癌的离体研究   总被引:2,自引:1,他引:1  
利用DNA重组技术,将HSV-TK基因克隆至逆转录病毒载体(XM-6/TK)。经PA317细胞包装后,转染人肝癌细胞HepG2。结果显示,XM-6/TK转染HepG2细胞与野生型相比,其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物-环氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)后,转染细胞生长受到严重抑制,细胞数量明显降低。细胞学检查证实,GCV处理后,转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示,应用HSV-TK基因治疗肝癌可能为一种治疗肿瘤新的方法  相似文献   

20.
Bcl——2基因表达对TNF及OA诱发的细胞编程死亡的不同效应   总被引:1,自引:0,他引:1  
陈亚兵  蔡毓 《生命科学》1996,8(2):17-18
用TNF和OA(Okadaicacid)诱发人神经母细胞瘤SK细胞死亡,并证明细胞死亡为编程死亡(ProgrmmedCellDeath,简称PCD)。将编码Bcl-2全长蛋白的cDNA植入PJX41neo载体中,使其表达由HCMV病毒起动子控制。形成的顺义(pBcl-2-S)及反义(pBcl-2-AS)表达质粒经转染导入SK细胞中获得稳定转染子。Western印迹表明顺义转染子表达大量的26kdBcl-2蛋白,而反义转染子则不表达。增强表达的Bcl-2蛋白能抑制由TNF引发的PCD,但不影响OA引发的PCD,从而证明了Bcl-2基因产物抗细胞死亡效应的特异性。  相似文献   

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