干扰血红素加氧酶-1改善黑色素瘤细胞对顺铂耐药性的机制研究

目的:探讨血红素加氧酶-1(HO-1)对皮肤黑色素瘤细胞耐药性的影响并分析其分子机制。方法:采用慢病毒载体介导RNA干扰HO-1稳定低表达的恶性皮肤黑色素瘤细胞A375(KD组),用RT-PCR和Western印迹验证其干扰效率;CCK-8法检测HO-1敲减后细胞的增殖情况及对药物顺铂的敏感性变化;流式细胞术检测顺铂对细胞凋亡的影响;RT-PCR及Western印迹检测顺铂处理的HO-1稳定敲减细胞系中凋亡相关基因的变化。结果:构建了HO-1稳定低表达的A375细胞株,敲低HO-1明显抑制细胞增殖;敲低HO-1后细胞对顺铂的敏感性增加,在低浓度顺铂(0.25～6μg/m L)处理的情况下,A375-sh HO-1细胞抑制率比正常A375细胞高8倍以上;顺铂处理后,在RNA水平和蛋白水平上A375-sh HO-1细胞中凋亡相关基因Bax、active Caspase-3显著增加,并降低Bcl-2的表达。结论:RNA干扰抑制HO-1基因表达能够增强皮肤黑色素瘤细胞A375对顺铂的敏感性。     

硫酸化茯苓多糖对人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响

为了探讨硫酸化茯苓多糖(SP)对人乳腺癌细胞株MCF-7凋亡的影响,采用MTT法检测不同浓度、作用时间SP对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用,倒置显微镜观察MCF-7细胞的形态学变化,RT-PCR检测SP处理MCF-7细胞凋亡相关基因(Bcl-2,Bax)的表达;Western blotting技术检测SP对乳腺癌细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达变化。结果表明,SP对MCF-7细胞增殖有抑制作用,且在一定范围内呈剂量效应;细胞贴壁能力减弱,细胞间隙增大,胞膜褶皱;Bcl-2基因表达水平和蛋白表达水平明显降低(p0.05),Bax基因表达水平和蛋白表达水平明显升高(p0.05)。基于以上研究,SP通过促凋亡基因Bax的表达,抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达来下调Bcl-2/Bax比值,激活凋亡途径,诱导MCF-7细胞的凋亡。     

大蒜素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

该研究探讨了大蒜素诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡及其作用机制。用不同浓度大蒜素作用人胃癌SGC-7901细胞48 h。通过MTT法检测细胞活性。光学、激光共聚焦显微镜下观察细胞形态变化。流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期。qRT-PCR和Western blot检测Bax、Bcl-2基因和蛋白的表达水平。结果显示,大蒜素处理细胞48 h的IC50值为78μg/m L,显微镜下可观察到明显的凋亡现象,细胞凋亡率为(61.15±3.77)%,细胞阻滞于G1期,Bcl-2基因和蛋白表达均下降,Bax基因和蛋白表达均增加(P0.05)。综上所述,在一定浓度范围内,大蒜素能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,诱导细胞凋亡,呈剂量依赖性,并可上调Bax基因表达,下调Bcl-2基因表达。     

Ad-IL-24对MG-63人骨肉瘤细胞抑癌效应的体内外实验

本研究旨在分析腺病毒携带的IL-24基因在体内外对人骨肉瘤细胞生长抑制效应及其分子机制。将Ad-IL-24重组腺病毒感染MG-63细胞,用荧光显微镜、RT-PCR法检测IL-24在MG-63细胞中的转录和表达;MTT法、流式细胞技术和Hoechst染色法检测IL-24基因的表达对MG-63细胞的生长抑制和凋亡效应;半定量RT-PCR法检测IL-24基因的表达对MG-63细胞中的bcl-2、bax、caspase-3相关基因表达的影响。用Ad-IL-24重组腺病毒在MG-63骨肉瘤荷瘤裸鼠的瘤体内进行注射治疗,观察肿瘤生长变化,15d后处死裸鼠,摘除瘤体,称瘤重。并通过免疫组化法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等与细胞凋亡相关因子的表达。结果表明Ad-IL-24重组腺病毒感染MG-63细胞后,能明显抑制MG-63细胞增殖,并能通过上调细胞中bax、caspase-3和下调bcl-2基因表达,诱导细胞凋亡,呈现出典型细胞凋亡形态学变化。Ad-IL-24重组腺病毒瘤内注射MG-63裸鼠荷瘤骨肉瘤移植瘤后,能显著抑制肿瘤生长,瘤重的抑制率可达52%,免疫组化结果显示Ad-IL-24重组腺病毒能明显上调与细胞...     

新狼毒素A诱导人黑色素瘤A375细胞凋亡的机制研究

为探讨新狼毒素A抑制人黑色素瘤A375细胞增殖及诱导凋亡的作用。本实验采用噻唑蓝(MTT)法检测新狼毒素A对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响,Hoechst33258法观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率和线粒体膜电位,Westernblot检测凋亡相关蛋白表达。结果显示新狼毒素A以时间剂量依赖性的方式显著抑制A375细胞的增殖;不同浓度新狼毒素A(0、15、30、45μmol/L)作用于A375细胞48h后细胞出现显著凋亡特征,新狼毒素A增加A375细胞的凋亡率且降低了线粒体膜电位,上调Bax、caspase-3和细胞色素C(CytochromeC)蛋白的表达,下调Bcl-2蛋白的表达。以上结果说明新狼毒素A抑制A375细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与诱导线粒体途径的凋亡有关。     

南方大斑蝥体内结合斑蝥素对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

利用水提法从来自罗甸县茂井镇的南方大斑蝥中提取得到结合斑蝥素,作用于人肝癌HepG2细胞后,分别利用Annexin V-FITC/PI双染法检测HepG2细胞的凋亡率,RT-PCR法检测Bax、Bcl-2mRNA相对表达情况,利用Western blot法检测HepG2细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。实验结果表明罗甸县茂井镇产的南方大斑蝥体内结合斑蝥素可诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,其机制可能与上调Bax和下调Bcl-2表达有关。     

人RARα基因重组腺病毒表达质粒的构建及其对人白血病NB4细胞的影响研究

利用AdEasy系统构建携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染人白血病NB4细胞后用生理浓度的维甲酸诱导,观察其对NB4细胞增殖和分化的影响。以急性早幼粒细胞株NB4的cDNA为模板,PCR扩增RARα基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα。用EcoR V和Sal I双酶切及测序鉴定,然后与骨架质粒AdEasy-1同时转化大肠杆菌BJ5183菌株的感受态,经同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-RARα。酶切验证后,Pac I酶线性化后转染AD293细胞,包装出重组腺病毒Ad-RARα,经3轮扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。流式细胞术测定病毒感染效率,Western blot法检测重组腺病毒感染的人NB4细胞中RARα蛋白和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,CCK-8法检测重组腺病毒感染对NB4细胞增殖的影响,Annexin V/PI双染法测定细胞周期,PI测定细胞凋亡。重组腺病毒穿梭质粒pAdTrace-TO4-RARα经双酶切及测序证明构建正确,病毒感染效率可达70%,与空载体感染及未感染的NB4细胞相比,重组腺病毒感染的NB4细胞内RARα蛋白的表达明显升高(P0.05),且经生理浓度全反式维甲酸ATRA处理后,能够有效地促进感染重组腺病毒细胞的分化成熟和凋亡。该研究成功构建了携带人RARα基因的重组腺病毒表达质粒,感染NB4细胞后可促进细胞增殖,经生理浓度维甲酸诱导后能促进NB4细胞分化成熟和凋亡,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

Ad.RGD-ING4-PTEN对MEG01人白血病细胞的抑制作用

目的:构建RGD修饰的ING4和PTEN双基因共表达重组腺病毒载体(Ad.RGD-ING4-PTEN),研究其对人白血病细胞MEG01的抑制作用。方法:采用AdEasyTM腺病毒重组系统,在本科室已成功构建的pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter、pAdTrack-CMV-polyA-promoter腺病毒转移质粒的基础上,在多克隆酶切位点的Not I、Xho I间插入PTEN片段,得到pAdTrack-CMVING4-polyA-promoter-PTEN重组转移载体,与RGD-4C修饰的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1(RGD)同源重组后,经包装和扩增获得ING4和PTEN双基因共表达重组腺病毒Ad.RGD-ING4-PTEN。将Ad.RGD-ING4-PTEN体外感染人白血病细胞MEG01,检测腺病毒对MEG01细胞的感染效率,Western blot法检测外源基因ING4和PTEN在MEG01细胞中的表达,CCK8法检测外源基因的导入对MEG01细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测外源基因导入对MEG01细胞的凋亡和周期的影响。结果:鉴定结果显示,成功构建了Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达腺病毒,其能有效地感染MEG01细胞。Western blot检测到ING4和PTEN在MEG01细胞中的表达;ING4和PTEN基因能明显抑制MEG01细胞的生长,诱导其凋亡并产生G2/M期阻滞作用,且双基因联合作用较单基因作用更明显。结论:成功构建了RGD-4C修饰的ING4和PTEN双基因共表达腺病毒载体Ad.RGD-ING4-PTEN。收获的腺病毒能有效感染人白血病MEG01细胞。Ad.RGD-ING4-PTEN具有抑制MEG01细胞的生长、诱导其凋亡及G2/M期阻滞的作用。     

Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞生长抑制的体外实验

旨在研究携带人IL-24基因的腺病毒表达载体(Ad-IL-24)对SGC-7901人胃癌细胞的生长抑制作用并分析其分子机制。以不同MOI(感染复数)的Ad空载体腺病毒感染SGC-7901人胃癌细胞,筛选出最佳感染剂量;Ad-IL-24以最佳感染剂量感染SGC-7901胃癌细胞,RT-PCR法和Western blotting法检测腺病毒介导的IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中的转录;MTT法检测Ad-IL-24对SGC-7901胃癌细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测其诱导SGC-7901人胃癌细胞凋亡和细胞周期改变的效应,Hoechst33258染色荧光显微镜检测其诱导胃癌细胞凋亡的核形态改变;RT-PCR半定量法进一步检测SGC-7901胃癌细胞中凋亡相关基因的转录。结果显示,100MOI为感染SGC-7901胃癌细胞的腺病毒最佳感染剂量;Ad-IL-24能成功介导IL-24基因在SGC-7901胃癌细胞中转录性表达;Ad-IL-24感染SGC-7901胃癌细胞后,能明显抑制胃癌细胞生长和诱导凋亡;Ad-IL-24能显著上调SGC-7901胃癌细胞中bax、caspase-3和p53的表达和下调bc...     

STAT3小干扰RNA的构建及对缺氧复氧人肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的:构建信号转导与转录因子3(STAT3)小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对缺氧复氧后人肾小管上皮细胞(HKC)凋亡的影响。方法:设计3对人STAT3 siRNA靶序列,用DNA重组技术克隆至质粒pRNAT-U6.1/neo中,构建重组质粒pRNAT-U6.1-STAT3 siRNA,检测并筛选出最佳抑制效率的siRNA质粒载体。重组质粒转染至缺氧复氧后HKC细胞,Western blotting和Real Time-PCR测定STAT3蛋白和mRNA表达量,流式细胞仪测定细胞凋亡,间接荧光法测定Bcl-2和Bax表达的变化。结果:靶向STAT3基因表达的质粒载体构建成功,并筛选出抑制效率最佳的重组质粒。缺氧复氧后HKC细胞STAT3表达、凋亡率和Bax/Bcl-2比值增加;缺氧复氧后HKC细胞转染重组质粒后STAT3表达、凋亡率和Bax/Bcl-2比值明显降低。结论:成功构建并筛选最佳抑制效率的靶向STAT3的重组质粒载体。该载体可有效抑制缺氧复氧后HKC细胞中STAT3信号转导通路的活化,并进一步通过上调Bcl-2、下调Bax蛋白的表达,从而抑制细胞凋亡。     

腺病毒载体AdING4 对MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制及化疗增敏作用

目的:研究腺病毒载体AdING4对人MCF-7乳腺癌细胞的生长抑制及化疗增敏作用。方法:将搭载有ING-4基因的重组腺病毒载体AdING4感染人MCF-7乳腺癌细胞,用荧光显微镜观察感染后的MCF-7细胞形态学变化;RT-PCR和Western-Blot法检测ING-4基因在MCF-7细胞中的转录和表达;RT-PCR法检测凋亡相关基因在MCF-7细胞中的表达;CCK法测定Ad-ING4感染MCF-7乳腺癌细胞后所发挥的细胞增殖抑制作用。流式细胞技术检测ING-4对MCF-7乳腺癌细胞的促凋亡作用。CCK-8法分别测定病毒感染前后的MCF-7乳腺癌细胞的药物半数抑制浓度IC50,并观察Ad-ING4与化疗药物合用后对MCF-7细胞增殖抑制和化疗增敏现象。结果:MCF-7细胞在转染ING-4基因后,明显出现变圆、脱落、皱缩、聚集等现象;外源性ING-4基因在MCF-7细胞中获得成功表达;外源性ING-4基因作用下MCF-7细胞的增殖受到了明显抑制,凋亡率有所升高,凋亡相关基因Bax的表达水平明显上调,Bcl-2、Survivin的表达水平明显下调。ING-4基因感染MCF-7细胞后,使MCF-7细胞对相关化疗药物的敏感度更高;ING-4基因与化疗药物合用后对MCF-7细胞的增殖抑制作用,较之单用化疗药物更为明显。结论:MCF-7细胞在转染ING4基因后其增殖受到了明显抑制并更易凋亡,该现象可能是通过改变Bax,Bcl-2及Survivin表达水平来实现的,且对化疗药物的敏感性更高。     

斜生褐孔菌多糖诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡的研究

研究了斜生褐孔菌多糖对人类肝癌HepG-2细胞凋亡的诱导作用。采用噻唑蓝法(MTT法)观察了斜生褐孔菌多糖对HepG-2细胞生长的影响,用透射电镜观察了细胞形态,用DNA Ladder检测了细胞凋亡,用流式细胞仪检测了细胞凋亡率;同时采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR法)研究了不同浓度斜生褐孔菌多糖作用后HepG-2细胞中Bax和Bcl-2基因mRNA转录水平的变化。结果表明斜生褐孔菌多糖能抑制HepG-2细胞增殖,并呈时间剂量依赖关系;电镜观察、DNALadder和流式细胞仪检测均证实了斜生褐孔菌多糖能够诱导HepG-2细胞凋亡;经斜生褐孔菌多糖处理后,HepG-2细胞中Bax基因mRNA转录水平增强,而Bcl-2基因mRNA无明显变化。证明了斜生褐孔菌多糖具有抑制HepG-2细胞生长及诱导HepG-2细胞凋亡的作用,这可能与调节Bcl-2和Bax基因表达水平有关。     

Bax/Bcl-2 mRNA在恒河猴药物流产胎盘中的表达

目的：通过检测重要的细胞凋亡调节因子Bax和Bcl-2的表达,探讨恒河猴胎盘细胞凋亡与药物流产的关系。方法：利用RT-PCR和原位杂交的方法检测恒河猴对照组和药物流产组(RU-486与AG诱导)胎盘中Bax和Bcl-2mRNA的表达。结果：Bax mRNA在流产胎盘中的表达量明显高于对照组胎盘。在胎盘绒毛滋养层细胞可见明显表达,基底层蜕膜细胞也有表达。Bcl-2mRNA在流产胎盘中的表达量明显低于对照组胎盘,表达部位与Bax类似。结论：RU-486和AG可能通过上调Bax mRNA和下调Bcl-2mRNA的表达,导致胎盘组织凋亡细胞的数量明显增加,从而影响胎盘的正常结构和功能,增加了流产的危险性。     

镉诱导小鼠睾丸细胞凋亡与Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA的表达

一个月大雄性小鼠24只,随机分为6组,用30 μmol/kg CdCl2作用小鼠睾丸不同的时间(3 h、6 h、12 h、18 h、24 h)后,利用DNA电泳、免疫组化和半定量RT-PCR技术,分析生殖细胞凋亡过程中三种关键物质Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白和mRNA的表达量变化.结果显示:1) DNA各组 (除对照组外)均出现不同程度断裂.2)Caspase-3蛋白表达量一直上升,与对照组相比差异极显著;Bax蛋白在12 h前一直上升,与对照组相比差异显著,12 h后又开始下降,且与对照组相比无显著差异;Bcl-2蛋白在下降,与对照组相比差异显著.3)RT-PCR结果显示Caspase-3基因表达量减少;Bax基因表达量逐渐上升;Bcl-2基因表达量波动很大.综上所述,Caspase-3、Bcl-2和Bax三个基因可能参与了镉应激状态下小鼠睾丸组织细胞的凋亡过程.     

PESV 对K562 细胞BCR/ABL 融合基因及凋亡调控因子Bcl-2、Bad 表达的影响

目的:探讨PESV对K562细胞BCR/ABL融合基因及凋亡调控因子bcl-2和bad表达的影响.方法:将体外培养K562细胞,经PESV处理不同时间后,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光定量RT-PCR检测BCR/ABL、Bcl-2、Bad mRNA水平变化.结果:与对照组相比,PESV处理后K562细胞,凋亡率增加,BCR/ABL融合基因表达降低,抗凋亡相关基因Bcl-2 mRNA表达降低,促凋亡基因Bad mRNA表达增加.结论:PESV能降低降低K562细胞BCR/ABL融合基因的表达,可能通过调节Bcl-2和Bad表达,抑制K562细胞增殖,促进其凋亡.     

血管细胞黏附分子-1对卵巢癌细胞凋亡的影响及机制研究

目的:探讨过表达血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)对卵巢癌细胞凋亡的影响。方法:构建过表达VCAM-1的慢病毒载体GV358-VCAM1+,转染人类卵巢癌IGROV1细胞株,利用嘌呤霉素筛选稳定表达VCAM-1的IGROV1细胞,通过倒置荧光显微镜下观察绿色荧光,确定细胞转染效率,Western blot及RT-PCR法确定卵巢癌细胞VCAM-1蛋白和m RNA水平;采用流式细胞仪检测过表达VCAM-1的IGROV1的细胞凋亡变化,western blot法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3)以及STAT3、p-STAT3蛋白表达水平的变化。结果:成功构建的慢病毒载体GV358-VCAM1+在IGROV1细胞中的转染效率达到85%以上,转染细胞的VCAM-1蛋白及m RNA水平均呈稳定表达;VCAM-1过表达卵巢癌细胞的细胞凋亡显著高于空载体对照组(P=0.0149);Bax、Casepase-3、Cleaved Casepase-3表达水平均较对照组显著升高(P0.01),Bcl-2、p-STAT3表达水平明显低于对照组(P0.01),但STAT3表达水平无显著改变。结论:VCAM-1可能通过下调STAT3的磷酸化水平诱导卵巢癌细胞凋亡。     

紫草素对人脑胶质瘤U251 细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察紫草素对体外培养的人脑胶质瘤U251细胞的增殖和凋亡的影响。方法:应用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分别检测2.5、5、10μM/L的紫草素对U251细胞的体外抑杀作用以及凋亡诱导作用,进一步应用Western blot方法检测紫草素对凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达水平的影响。结果:紫草素对人U251胶质瘤细胞具有明显的增殖抑制作用,且呈一定的剂量依赖性和时间依赖性。紫草素可明显上调U251细胞Bax的表达,下调Bcl-2的表达,与对照组相比存在显著性差异(P0.05)。结论:紫草素对人胶质瘤U251细胞具有明显的抑制增殖和促进凋亡作用。