p53基因敲除大鼠模型的构建及表型分析

使用TALEN技术制作p53基因敲除大鼠模型,建立种群并分析大鼠表型。设计特异性识别p53基因外显子2的TALEN蛋白并构建相应载体,将体外转录的TALEN m RNA注射SD大鼠受精卵,出生后从仔鼠中通过测序筛选靶位点正确剪切的阳性小鼠。结果显示,注射得到11只新生仔鼠,通过测序发现其中有10只靶位点发生剪切。选取其中4只作为首建鼠进行繁殖。p53基因敲除纯合子表现出肿瘤易发性,主要自发性肿瘤类型为恶性纤维组织肉瘤。此外,p53基因敲除纯合子大鼠表现出眼睛发育异常,视网膜变性及晶状体纤维排列紊乱。通过TALEN技术高效地获得了p53基因敲除大鼠模型,纯合子敲除大鼠除了易发肿瘤并伴有眼发育异常,因而该敲除大鼠模型除了可用于研究肿瘤发生机制外,也可用于研究p53基因在眼发育过程中的功能。     

IL2rg-/-大鼠支持人RSV在体内的长期感染

目的 为了克服已有人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, hRSV)动物模型的局限性,如半受纳性和感染持续时间短,本文利用TALEN基因编辑技术建立了IL2rg基因敲除(IL2rg^-/-)的大鼠模型。方法 用hRSV滴鼻感染该动物模型,观察感染期(0～35 d)的临床表征、体重及体温变化;记录不同时间点(滴鼻感染后第4、11、20、35天)鼻腔、气管、肺等呼吸道脏器的病毒总拷贝数;在观察终点(滴鼻感染后第35天)对感染动物的靶器官进行病理分析;观察不同时间点(滴鼻感染后第4、20、35天)外周血T、B、NK、NKT细胞的变化及不同时间点多种细胞因子的变化。结果 (1)通过鼻内接种hRSV后,纯合的IL2rg基因敲除大鼠的呼吸道内能保持较高的病毒载量,鼻腔中病毒的平均峰值滴度能快速升至1×10¹⁰ copies/g,至第5周时,病毒依然能维持复制,病毒载量亦可达到1×10⁷ copies/g。(2)但其鼻、气管和肺组织,无明显病变。(3)感染hRSV的IL2rg^-/...     

c—Ha-ras在转基因小鼠模型C57-ras各组织中的表达谱分析

目的：分析转基因c-Ha-ras在C57-ras癌症小鼠模型中的组织表达谱及时空表达差异。方法：利用半定量及荧光定量RT-PCR法,分析不同首建鼠系、不同周龄小鼠各脏器中转基因c-Ha-ras的表达。结果：转基因c-Ha-ras在心、肝等13种组织器官中均有表达,在肺脏中表达最高,在肝脏中表达最低,No.2、No.3和No.5等3个首建鼠均呈现相似的变化规律;转基因在No.5首建鼠中表达水平最高,而在同一个首建鼠系中,12周龄时表达高于8周龄和24周龄。结论：转基因c-Ha-ras在各脏器中能高效表达,并间接表明该转基因能稳定遗传,为C57-ras癌症小鼠模型用于新药临床前致癌性评价提了供理论支持。     

利用荧光定量PCR分析c-Ha-ras基因在C57-ras转基因小鼠中的拷贝数

目的:利用real-time PCR建立检测C57-ras转基因小鼠中外源c-Ha-ras基因拷贝数的简便方法,为药物安全性评价C57-ras转基因小鼠模型的繁殖和筛选提供数据支持。方法:以自建的人原癌基因c-Ha-ras转基因小鼠为研究对象,利用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR的绝对定量法测定3个C57-ras转基因小鼠系的c-Ha-ras基因Ct值,通过与内参基因GAPDH比较计算获得转基因的拷贝数。结果:内参基因GAPDH的标准曲线为lg NGAPDH=-2.852Ct+26.236,外源基因c-Ha-ras的标准曲线为lg NRAS=-3.068Ct+39.186;经计算,NO.2、NO.3、NO.5系的F6代拷贝数分别为4、4和3,并且系内不同个体间拷贝数一致。结论:利用SYBR GreenⅠreal-time PCR技术建立了检测C57-ras转基因小鼠中外源基因拷贝数的方法,该方法操作简单,节约成本,为C57-ras致癌性模型的选留和应用提供了基础和技术手段,也为其他类似转基因品系中转基因拷贝数的确定提供了一种参考方法。     

模式小鼠总DNA三种提取方法比较

目的：建立简便、快捷、经济的模式小鼠总DNA提取方法,以快速鉴定大批量模式小鼠基因型。方法采用苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法提取同种模式小鼠总DNA,对比DNA纯度、得率、耗费时间,并比较基因型鉴定结果。结果苯酚抽提法得率最高,异丙醇沉淀法最低;而纯度则按照苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法顺序递减;在耗时上鼠耳煮沸法最短。三种方法提取的DNA均可做模版用于基因型鉴定。结论鼠耳煮沸法操作简单、成本最低,快速、基因型鉴定结果可靠,可用于规模化的基因型鉴定实验中。