人骨钙素蛋白在毕赤酵母中表达条件的优化

目的:在已构建的人骨钙素蛋白p PIC9K-BGP表达载体的基础上,进行表达条件优化,提高其表达含量,为研究其对2型糖尿病的作用机制奠定研究基础。方法:将前期构建的p PIC9K-BGP载体转入毕赤酵母中,以人骨钙素试剂盒鉴定不同诱导剂浓度、不同诱导温度和不同诱导时间对蛋白表达量的影响。结果:在诱导温度28℃、加入0.5%的甲醇诱导、诱导时间为96h时获得较高的分泌性蛋白的表达量。结论:优化了骨钙素在毕赤酵母中的表达条件,提高了表达量。     

成纤维细胞生长因子21的研究进展*

成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21,FGF21）是一种主要的脂肪代谢调节因子,主要在肝脏中表达;FGF21有助于肝脏的脂肪代谢以及生酮反应,可以促进脂肪细胞摄取葡萄糖,促进胰岛素分泌,延缓肿瘤的发展等功能。近年来研究过程中发现,FGF21可以用于糖尿病和降血脂等其他代谢疾病治疗。主要对FGF21的特点,作用机理及其分子机制进行了概括,并对FGF21在糖尿病治疗和降血脂方面的研究进行了综述。     

rSalmosin-Mel融合蛋白的制备及对乳腺癌细胞MCF-7的作用扩散机制初步研究

为了充分利用肿瘤细胞表面的一些特异性分子,探寻肿瘤的靶向治疗途径,研发新的肿瘤靶向药物。本研究以去整合素蛋白Salmosin作为载体,MMP-2切割位点氨基酸序列作为接头,蜂毒肽作为毒素分子,构建了r Salmosin-Mel毕赤酵母真核表达载体。通过甲醇诱导r Salmosin-Mel蛋白的分泌表达至培养中,经过QSepharose HP和Sephadex G-75分离得到纯度大于95%的重组蛋白。体外抗肿瘤活性结果表明,r Salmosin-Mel能浓度依赖性的抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖。进一步研究发现r Salmosin-Mel能诱导MCF-7细胞凋亡,其机制可能与抑制NF-κB蛋白的活化相关。本研究建立了r Salmosin-Mel蛋白的制备工艺,初步阐明了其抑制乳腺癌癌增殖的分子机制。     

HSV-2gD重组腺病毒疫苗的构建及免疫原性分析

Ⅱ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 2,HSV-2)是引起生殖器疱疹(Genital herpes,GH)的主要病原体,研制有效的HSV-2疫苗是控制病毒传播的有效途径,本研究通过穿梭载体pDC316将糖蛋白D2(Glucoprotein D2,gD2)基因连接到腺病毒载体上,制备HSV-2重组腺病毒rAd-gD2,经PCR和Western blot的方法在基因和蛋白水平上鉴定正确后,分别于第0、2、4周免疫小鼠,以PBS和空白腺病毒载体(AdV)为对照,第7周取血,通过检测小鼠血清中gD2特应性IgG和中和抗体评价体液免疫应答,检测Th1/Th2型细胞因子评价细胞免疫应答。结果显示经过3次免疫,小鼠产生了高水平的gD2特应性IgG和较高水平的中和抗体,Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2明显高于对照组,Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-10均高于对照组,P0.01,具有显著的统计学意义。本研究制备的rAd-gD2既可以刺激小鼠产生体液免疫应答,也可以产生细胞免疫应答,与预期设想一致,为未来HSV-2疫苗的研发提供了数据基础。     

生物技术专业应用型人才培养模式的研究与实践

生物技术专业学生,毕业后大量从事技术操作工作,例如在生物医药公司、医学院校实验室等从事实验和技术操作,面临所学知识的不断更新和技术的不断发展,做到这些必须具备良好的综合素质和创新能力。根据生物技术专业的特点,结合理工医学科优势,从适应产业发展的角度,本文主要就挖掘一体化创新人才培养新途经、夯实多元化本科知识基础和构建医学院校实践教学体系三方面为产业培养应用型人才进行探索。     

T2毒素的纯化及抗肝癌活性的研究

[目的]纯化T2毒素并探讨其抗肝癌活性。[方法]采用萃取法、柱层析法和高效液相色谱法从污染的玉米粒中分离T2毒素,采用MTT法、结晶紫染色法、荧光染色法考察其对两种肝癌细胞数量和形态的影响,划痕实验考察对细胞迁移的影响。[结果]纯化后,T2毒素纯度达到98%;当T2毒素浓度为8μg/mL时,对肝癌细胞的抑制率分别为(95±1.34)%(Hep G2)和(97±2.59)%(SMMC-7721),IC50分别为0.003 77μg/mL和0.003 25μg/mL,且有剂量依赖性。给药24 h后,与对照组相比,贴壁细胞减少,细胞体积缩小,肿瘤细胞迁移能力减弱。[结论]T2毒素能够成为一种潜在的抗肝癌药物。     

一种实时荧光定量PCR检测Ⅱ型单纯疱疹病毒检测方法的研究

建立SYBR Green实时荧光定量PCR方法,用于快速、准确检测Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)。设计特异性引物,PCR扩增糖蛋白G(g G)片段,构建p EASY-T1-g G2重组质粒作为标准品,绘制标准曲线,同时考察该方法的稳定性、灵敏性和特异性,并利用此方法检测HSV-2血清学确诊的生殖器疱疹临床样本。本实验获得的标准曲线R~2=0.997,相关性良好,灵敏度是普通PCR的1 000倍。用本方法检测HSV-2血清学确诊的生殖器疱疹临床样本均为阳性,符合率为100%,且每份样品检测结果的变异系数均小于2%。本研究建立的SYBR Green实时荧光定量PCR方法可用于临床HSV-2感染的检测。     

pET3c-FGF2K18S/S69C突变体的构建及表达条件优化

构建和表达人FGF2K18S/S69C 突变体,并筛选最佳的表达条件.对GenBank数据库FGF2序列进行分析后,发现了位于第18位和第69位的氨基酸定向突变之后,能够增加FGF2稳定性.基因合成FGF2K18S/S69C突变体,与载体pET3c连接后转化至大肠杆菌BL21中,用乳糖诱导,以蛋白质表达量为指标,考察诱导剂浓度、装液体积、诱导时机、时间和温度对表达量的影响.成功构建pET3c-FGF2K18S/S69C突变体重组质粒,经菌落PCR、双酶切法和测序法证实质粒构建正确,目的片段长度约447 bp.在BL21中成功表达,FGF2K18S/S69C最佳发酵工艺为:装液量30 mL/250 mL锥形瓶,A600为0.8,乳糖浓度0.5 g/L,37℃、180 r/min诱导4 h.Western blot分析该表达产物表明,该蛋白质可以和人FGF2抗体特异性结合.通过构建pET3c-FGF2突变体基因工程菌,并优化其表达条件,为后续研究FGF2K18S/S69C突变体提供了基础.     

奶牛妊娠相关糖蛋白BoPAG16的表达及其结构功能预测

[目的]为了获得奶牛妊娠相关糖蛋白16(bovin pregnancy associated glycoproteins 16,BoPAG16),并对该蛋白进行结构和功能分析。[方法]从荷斯坦奶牛胎盘子叶中扩增BoPAG16基因,并用构建真核表达载体pcDNA3.1-Flag-BoPAG16,转染至293F细胞中,用SDS-PAGE和Western Blotting检测表达效果,用Flag-tag亲和层析柱纯化蛋白,并对BoPAG16基因编码的蛋白进行结构和功能预测分析。[结果]BoPAG16基因在293F细胞中成功表达,大小为56 kDa,纯化后纯度达到92%。预测BoPAG16蛋白N端15个氨基酸为信号肽,6个糖基化位点和13个B细胞抗原表位。[结论]成功表达并纯化奶牛妊娠相关糖蛋白BoPAG16,BoPAG16蛋白有6个糖基化位点和13个B细胞抗原表位。