基因表达系列分析技术在真菌功能基因组学中的应用

基因表达系列分析( SAGE)是一种在mRNA水平上高通量、快速、灵敏分析细胞或组织基因表达信息,并在基因组学研究中广泛应用的技术.该技术不仅能够全面地分析特定组织或细胞表达的基因,比较不同时空条件下基因表达的差异,还可以在全基因组范围内获得基因的表达谱,从而发现新基因.综述基因表达系列分析技术在材料用量、标签长度、技术流程和标签测序等方面的研究进展及该技术在病原真菌、工业真菌和食用真菌功能基因组学中的应用.     

植物逆境胁迫抗性的功能基因组研究策略

植物对逆境胁迫抗性的功能基因组研究主要是寻找胁迫抗性位点在相关物种基因组中的保守位置,发现胁迫反应中的高度保守序列,确定植物胁迫反应的调控机理,进而得到植物对逆境胁迫抗性的关键代谢途径和其中的关键调控因子,为进一步选择用于改良植物对逆境胁迫抗性的关键基因奠定基础。本文从主要模式植物(苔藓类植物、复苏植物、盐土植物和甜土植物)、主要技术策略(基因的差异表达分析、基因表达序列标签、cDNA芯片技术。基因表达序列分析和基因敲除和突变体筛选分析)和生物信息学方法(数据分析的生物信息学方法设计到序列比较、比较基因组学、电子克隆)等三个方面对国内外植物逆境胁迫抗性的功能基因组研究策略作了全面综述。     

基因表达系列分析(SAGE)的研究进展

基因表达系列分析方法（SAGE）是一种新的基因表达分析方法,它可同时分析数千种转录子的表达情况.SAGE不仅可以定量分析已知基因,还可分析未知的基因表达情况.SAGE为从分子水平阐明疾病的发病机制找到有效的治疗靶位和诊断标志创造了条件.     

人血管内皮细胞缺氧早期基因系列表达分析文库的建立及分析

目的:建立常氧及缺氧早期人血管内皮细胞基因系列表达分析文库,对表达谱数据进行初步分析,为创伤后多器官功能障碍的防治奠定基础.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926),分为正常对照组和缺氧3h处理组.采用长标签基因系列表达分析方法(Long SAGE)建立常氧及缺氧3h组人血管内皮细胞基因表达文库,通过与Genebank数据库比对确认基因,对所得标签进行初步分析.结果:通过Long SAGE技术构建了常氧和缺氧脐静脉内皮细胞Long SAGE文库.缺氧SAGE文库测得30756个标签,其中识别出的基因总数为13879,比例为45.13%;重复的双标签体总数为762.常氧SAGE文库测得标签数为31213,其中识别出的基因总数为13665,比例为43.78%;重复的双标签体总教为758.结论:成功建立了人脐静脉内皮细胞常氧和缺氧早期LongSAGE文库,获得涵盖上万个转录本信息的表达谱数据,为创伤后多器官功能障碍的防治奠定基础.     

植物的功能基因组学研究进展

基因组研究计划包括以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学两方面的内容。目前基因功能鉴定的方法主要有：基因表达的系统分析(SAGE)、cDNA微阵列、DNA(基因)芯片、蛋白组技术以及基于转座子标签和T_DNA标签的反求遗传学技术等。本文对上述各种技术的优缺点以及它们在植物基因功能鉴定中的应用进行了综述。 Abstract: The genome projects comprise the structural genomics focusing on determining the complete sequences of the genome and the functional genomics focusing on elucidating the biological function of genes.The rapidly evolving tools for functional genomics research include Serial Analysis of Gene Expression (SAGE),cDNA microarray,DNA (or gene) chips,proteome project and the reverse genetics technique based on the well-established transposon tagging and T?DNA tagging systems.In this paper,the advantages and disadvantages of such techniques and application of these techniques in plant functional genomics research are reviewed and future prospective are also presented.     

植物的功能基因组学研究进展 Progress in Functional Genomics in Plants

基因组研究计划包括以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学两方面的内容。目前基因功能鉴定的方法主要有：基因表达的系统分析(SAGE)、cDNA微阵列、DNA(基因)芯片、蛋白组技术以及基于转座子标签和T_DNA标签的反求遗传学技术等。本文对上述各种技术的优缺点以及它们在植物基因功能鉴定中的应用进行了综述。 Abstract: The genome projects comprise the structural genomics focusing on determining the complete sequences of the genome and the functional genomics focusing on elucidating the biological function of genes.The rapidly evolving tools for functional genomics research include Serial Analysis of Gene Expression (SAGE),cDNA microarray,DNA (or gene) chips,proteome project and the reverse genetics technique based on the well-established transposon tagging and T?DNA tagging systems.In this paper,the advantages and disadvantages of such techniques and application of these techniques in plant functional genomics research are reviewed and future prospective are also presented.     

EST分析技术在鸡基因组学研究中的应用

表达序列标签（EST）是由大量随机取出的cDNA库克隆经测序得到的组织或细胞基因组的一段cDNA序列,一个EST代表生物体某种组织某一时期的一个表达基因。综述了EST分析技术在鸡基因组研究中的应用。如用于鉴定、发现和预测鸡的新基因,用于基因图谱的绘制,用于筛选基因的单核苷酸多态性（SNP）位点,用于基因表达分析和基因芯片制作等。EST数据库和生物信息学的联合分析技术在推动家鸡后基因组的研究中发挥着重要的作用。     

植物功能基因组研究方法及进展

随着植物功能基因组研究的深入,T-DNA标签、转座子标签、反义RNA技术、基因敲除、基因陷阱和TILLING技术等多种研究方法获得了建立,并随着植物功能基因组学的不断发展而进一步完善.综述了各类研究方法的原理,并对这些方法的优缺点进行了比较与分析.     

利用线粒体膜电位测定筛选参与细胞凋亡的人类新基因

细胞凋亡(apoptosis)属于细胞程序化死亡(programmed cell death),是细胞内涉及到许多生化反应的复杂过程.建立了基于细胞水平的凋亡筛选模型,用于筛选人类基因组中功能未知的序列,以发现与细胞凋亡相关的新基因.通过构建人类未知基因的表达文库,并将未知基因表达载体瞬时转染HeLa细胞,用阳离子染料JC-1标记HeLa细胞线粒体内膜并检测线粒体跨膜电位,用流式细胞术进行阳性结果的验证.经过对未知基因表达文库内600个新基因的筛选,得到7个线粒体跨膜电位下降相关新基因(CHMP6、CGI-38、hCAP-H2、NUDT16L1、ARMC1、PHF17和FLJ21103),经实验验证,其中3个基因(CHMP6、CGI-38和hCAP-H2)与细胞凋亡相关.结果表明,所建立的基于细胞的凋亡筛选模型稳定高效,3个细胞凋亡相关基因将被进行深入研究.     

激发标签技术在植物功能基因组研究中的应用

获得突变体是研究植物功能基因组的有效方法。与传统的T-DNA插入功能缺失突变相比, 建立在功能获得突变基础之上的激发标签技术具有独特的优势, 主要表现为可以获得功能冗余基因的显性突变体并方便地克隆相关基因。文章对激发标签技术的原理, 及其在拟南芥、水稻等植物功能基因组研究中的进展进行了综述, 并介绍了激发标签技术在植物抗逆、抗病和生长发育机理研究方面的新进展。文章最后探讨了激发标签技术的发展前景。     

基因表达系列分析技术的新进展

作为新近建立的研究基因表达的有效工具 ,基因表达系列分析 (SAGE)技术能同时对大量的转录物进行定性和定量分析。它不仅可以显示低丰度的转录物 ,提供基因组表达的完整信息 ,而且可以通过不同状态下基因表达图谱的比较 ,深入了解基因表达的时空性和有序性 ,从而寻找和发现新基因。本文介绍了SAGE的工作原理和方法 ,并着重对其最新的应用与研究进展进行了综述。     

烟芽夜蛾囊泡病毒3h株3h-38基因原核表达及转录、表达时相分析

烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothis virescens ascovirus 3h,HvAV-3h)作为一种极具生防潜力的环状双链DNA昆虫病毒,自被分离后,对其基因的特性和相关蛋白功能研究从未间断.本研究通过生物信息学预测3H-38蛋白序列发现其131～150氨基酸位置有一段由胞外向胞内的跨膜区序列,N端23 ～ 121氨基酸位置有一个BRO家族结构域,和其同源蛋白的序列对比发现3H-38与烟芽夜蛾囊泡病毒3i株(Heliothis virescens ascovirus 3i,HvAV-3i)和烟芽夜蛾囊泡病毒3j株(Heliothis virescens ascovirus 3j,HvAV-3j)编码的同源蛋白3I40和3J-43相似性高达85％以上.进一步通过RT-PCR克隆、构建pET-28a-38原核表达载体、IPTG诱导表达、Ni2+-NTA亲和层析柱纯化蛋白等方法获得了His-tag融合的3H-38重组蛋白,并制备了该蛋白的兔多克隆抗体.通过检测3h-38基因在HvAV-3h感染的甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)幼虫中的转录和表达时相,本研究发现3h-38从感染后3h开始转录,从感染后36 h开始表达,即3h-38是一个早期转录、晚期表达的基因.3h-38基因的生物学信息分析和转录表达时相检测为进一步研究该蛋白的功能和特性奠定了基础.     

Development of a spot reliability evaluation score for DNA microarrays

We developed a reliability index named SRED (Spot Reliability Evaluation Score for DNA microarrays) that represents the probability that the calibrated gene expression level from a DNA microarray would be less than a factor of 2 different from that of quantitative real-time polymerase chain reaction assays whose dynamic quantification range is treated statistically to be similar to that of the DNA microarray. To define the SRED score, two parameters, the reproducibility of measurement value and the relative expression value were selected from nine candidate parameters. The SRED score supplies the probability that the expression level in each spot of a microarray is less than a certain-fold different compared to other expression profiling data, such as QRT-PCR. This score was applied to 1,500,000 points of the expression profile in the RIKEN Expression Array Database.     

High-throughput analysis of gene expression on tissue sections by in situ hybridization

Genome-scale sequencing projects, high-throughput RNAi screens, systematic gene targeting, and system-biology-based network predictions all depend on a validation of biological significance in order to understand the relevance of a particular finding. Such validation, for the most part, rests on low-throughput technologies. This article provides protocols that, in combination with suitable instrumentation, make possible a semi-automated analysis of gene expression on tissue sections by means of in situ hybridization. Knowledge of gene expression localization has the potential to aid, and thereby accelerate, the validation of gene functions.     

拟南芥AtNHX2启动子的克隆及表达模式分析

AtNHX2基因是拟南芥NHX基因家族的一员,编码了一种液泡膜中的Na+/H+反向运输体并对拟南芥的耐盐能力起着重要的作用.采用PCR扩增的方法克隆了拟南芥AtNHX2基因启始密码子上游约2.8kb的DNA片段,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301-1中,通过基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达的方法,初步检测启动子的活性.将重组质粒pCAMBIA1301-1/AtNHX2 promoter转化拟南芥并筛选纯合子.AtNHX2 promoter-GUS分析显示AtNHX2在所有的组织中均有表达,包括根尖.在保卫细胞中检测到了强烈的GUS表达,这一结果表明,AtNHX2对特殊细胞的pH调控和K+自身稳定方面起着重要的作用.AtNHX2启动子的活性可被NaCl抑制,并且抑制的强度和NaCl的浓度成正相关.300 mmol/L KCl处理可增强启动子的活性,说明NaCl和KCl是在转录水平上调控AtNHX2的表达.在老叶中GUS活性比在新叶中GUS活性强,这说明了AtNHX2优先将有毒的离子积累在老叶中,从而有利于植物的正常发育.在根毛细胞中也观测到了强烈的GUS活性,这就暗示了AtNHX2在扩大的液泡中储存Na+.     

志贺毒素B（ShT-B）亚单位在两种表达载体中表达形式分析

用KpnⅠ和HindⅢ双酶切pGEMTB3克隆质粒,得到大小约为225bp的ShTB基因片段,分别将其插入到经双酶切的pQE40和pQE30表达载体中,构建了2个ShTB的重组表达质粒pQE40B3和pQE30B2,分别转化到E.coliM15,经IPTG诱导后,重组质粒目的蛋白均得到表达。其中,pQE40B3表达蛋白约占菌体总蛋白的37%,主要为包涵体形式。pQE30B2表达蛋白约占菌体总蛋白的16%,主要为可溶性形式,约9.2%。为重组抗原的制备提供了必要的物质基础。     

基于响应面分析方法的钩端螺旋体三联属特异性蛋白抗原原核表达条件的优化

脂蛋白LipL32和LipL21及穿膜蛋白OMPL1是问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性表面抗原,可作为通用型钩体基因工程疫苗抗原.[目的]在我们的研究中,为了获得使得重组人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2获得较高的表达水平,我们优化了重组宿主大肠杆菌的表达条件.[方法]我们采用了基于中心复合设计(CCD)的响应面分析方法(RSM).影响重组大肠杆菌生长的主要因素包pH、诱导剂IPTG浓度、诱导前培养实践、诱导时间以及诱导温度.响应面分析方法可以从这些因素中找到适合目的蛋白表达的最优表达条件.[结果]我们的结果显示在pH7.9、0.20mmol/LIPTG、诱导前培养时间2.5 h、诱导时间5.83 h、诱导后温度31℃条件下,可获得目的重组蛋白37.78 mg/L的最大表达量.[结论]实验结果表明采用基于中心复合设计的响应面分析方法能够较吹靥岣吣康牟锏牟?利用统计方法不但可以减少试验的次数,而且还能够从影响蛋白的因素中找出最重要的影响因素,因此该方法不仅对重组蛋白表达条件的优化有用,而且是一种很好的筛选方法.