烟芽夜蛾囊泡病毒3h株编码的3H-117蛋白能干扰AcMNPV的口服活性

[目的]囊泡病毒是一类体液传播的昆虫病毒,具有特殊的致病历程和良好的生防应用潜力.烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothis virescens ascovirus 3h,HvAV-3h)是我国分离的第一株囊泡病毒,其编码的3H-117蛋白被报道为HvAV-3h病毒粒子的结构蛋白.[方法]为了进一步探究3h-117基因...     

烟芽夜蛾囊泡病毒3h毒株3h-161的克隆和表达谱分析

【目的】本文旨在明确烟芽夜蛾囊泡病毒3h毒株（HvAV-3h）编码的第161号开放阅读框（3h-161）的序列特征及表达谱,为深入研究其功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆3h-161的CDs序列,构建原核表达载体,并制备高效的多克隆抗体;利用RT-PCR技术检测3h-161的转录情况,利用蛋白免疫印迹法检测3H-161的表达情况。【结果】3h-161编码区长516 bp,共编码172个氨基酸残基,感染甜菜夜蛾Spodopteraexigua3龄幼虫后12h开始转录、48h开始表达;3H-161在囊泡病毒属内的不同毒株（HvAV-3j、HvAV-3i、HvAV-3e、HvAV-3f和HvAV-3g）间高度保守,序列一致性为100%。【结论】本研究阐明了3h-161的序列特征、获得了3H-161的多克隆抗体,明确了其表达谱,为进一步研究该基因在HvAV-3h感染甜菜夜蛾过程中发挥的作用奠定基础。     

甜菜夜蛾半胱天冬酶基因的克隆及对细胞凋亡 诱导剂和病原微生物感染的表达响应

【目的】本研究旨在明确甜菜夜蛾Spodoptera exigua半胱天冬酶(caspase)在细胞凋亡诱导剂诱导和病原微生物胁迫下的表达模式,为丰富鳞翅目昆虫细胞凋亡机制研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR技术从甜菜夜蛾3龄幼虫体内扩增两个半胱天冬酶基因(SeCasp-3和SeCasp-4)编码区的全长;利用qPCR技术分别检测两个半胱天冬酶基因在细胞凋亡诱导剂过氧化氢(hydrogen peroxide, H₂O₂)(100 μmol/L)、放线菌素D(actinomycin D, ActD)(10 μg/mL)和地塞米松(dexamethasone, DEX)(50 μg/mL)诱导后甜菜夜蛾脂肪体细胞中及病原菌苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis kurstaki (Btk)(10⁸个细菌/mL)、大肠杆菌TG1菌株Escherichia coli TG1 (E. coli TG1)(10⁸个细菌/mL)、烟芽夜蛾囊泡病毒3h株(Heliothis virescens ascovirus 3h, HvAV-3h)(1.16×10¹¹个基因组拷贝/mL)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)(5 000 OBs/μL)感染后甜菜夜蛾3龄幼虫体内的表达模式。【结果】SeCasp-3(GenBank登录号: MW183334)的编码区长942 bp,共编码313个氨基酸;SeCasp-4(GenBank登录号: MW183335)的编码区长843 bp,共编码280个氨基酸。SeCasp-3和SeCasp-4的假定蛋白序列与家蚕Bombyx mori Dronc的氨基酸序列一致性分别为45.54％和58.46％,且SeCasp-3和SeCasp-4之间具有较高的同源性。SeCasp-3和SeCasp-4在不同化学物质诱导下的甜菜夜蛾脂肪体细胞中的表达模式存在明显差异,在100 μmol/L H₂O₂和10 μg/mL ActD处理后24和48 h,脂肪体细胞中SeCasp-3和SeCasp-4的相对表达量均显著升高;50 μg/mL DEX处理后24和48 h,SeCasp-3的相对表达量未见显著变化,但SeCasp-4的相对表达量升高了数千倍。在不同病原微生物感染后的甜菜夜蛾3龄幼虫体内,SeCasp-3和SeCasp-4的表达模式基本相同。一般线性模型的分析结果表明,Btk和E. coli TG1的感染不造成SeCasp-3和SeCasp-4相对表达量的显著变化,而HvAV-3h和AcMNPV的感染则显著抑制了这两个基因的表达。【结论】本研究鉴定了两个甜菜夜蛾半胱天冬酶基因,并分析了其对细胞凋亡诱导剂和病原微生物感染的表达响应,为进一步探究半胱天冬酶功能和昆虫细胞凋亡过程提供了重要的理论基础。     

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。     

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。     

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的组装

本文利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)结构蛋白编码基因的重组杆状病毒vAcHCVspl,并获得了HCV结构蛋白在昆虫细胞Sf21中的表达。HCV mRNA转录和蛋白质表达时相分析表明,感染后16h HCV结构蛋白编码基因开始转录,72h达最高峰;蛋白质表达则是在感染后48h开始,72h达到高峰。电镜观察表明vAcHCVspl感染的Sf21细胞96h时在细胞质中可见很多空泡,空泡中可见50nm的球形颗粒,为HCV结构蛋白组装的病毒样颗粒。     

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的组装

本文利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了含有丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)结构蛋白编码基因的重组杆状病毒vAcHCVsp1,并获得了HCV结构蛋白在昆虫细胞Sf21中的表达.HCV mRNA转录和蛋白质表达时相分析表明,感染后16 h HCV结构蛋白编码基因开始转录,72 h达最高峰;蛋白质表达则是在感染后48h开始,72 h达到高峰.电镜观察表明vAcHCVsp1感染的Sf21细胞96 h时在细胞质中可见很多空泡,空泡中可见50nm的球形颗粒,为HCV结构蛋白组装的病毒样颗粒.     

SeMNPV组织蛋白酶基因的克隆表达及其对病毒杀虫的影响

对甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeMNPV)的组织蛋白酶(v-cath)基因进行了克隆,序列分析及原核表达.此基因编码区长1014bp,预计编码一个338个氨基酸的蛋白产物,其蛋白的大小约42kD.序列分析表明,SeMNPV的V-CATH与其它杆状病毒的同源蛋白具有相似的保守结构,保留有相同的酶活性位点.根据几种已知的杆状病毒组织蛋白酶序列构建进化树,发现SeMNPV的V-CATH位于NPV组中一个单独的分支,它可能拥有特殊的进化历程.使用1.2μL的表达组织蛋白酶菌液和SeNPV共感染3龄末甜菜夜蛾幼虫,幼虫病毒致死率提高9.21%,病毒致死时间提前12 h,原核表达的组织蛋白酶对病毒杀虫速度有一定的影响.     

SeMNPV组织蛋白酶基因的克隆表达及其对病毒杀虫的影响

对甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeMNPV)的组织蛋白酶(v-cath)基因进行了克隆,序列分析及原核表达。此基因编码区长1014bp,预计编码一个338个氨基酸的蛋白产物,其蛋白的大小约42kD。序列分析表明,SeMNPV的V-CATH与其它杆状病毒的同源蛋白具有相似的保守结构,保留有相同的酶活性位点。根据几种已知的杆状病毒组织蛋白酶序列构建进化树,发现SeMNPV的V-CATH位于NPV组中一个单独的分支,它可能拥有特殊的进化历程。使用1.2μL的表达组织蛋白酶菌液和SeNPV共感染3龄末甜菜夜蛾幼虫,幼虫病毒致死率提高9.21%,病毒致死时间提前12 h,原核表达的组织蛋白酶对病毒杀虫速度有一定的影响。     

白木香 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合酶(AsHMGS)基因的克隆与表达分析简

以白木香（Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg）茎cDNA为模板,采用反转录PCR及RACE技术分离得到HMGS基因cDNA全长。序列分析表明该基因序列全长1 831 bp,共编码465个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.4 kD,理论等电点6.25,命名为AsHMGS。推导的AsHMGS蛋白质序列具有植物HMGS酶的典型结构,并预测出HMGS酶的活性中心。系统进化树分析表明,AsHMGS蛋白与拟南芥、琴叶拟南芥、芥菜的相应蛋白相似度最高,其次为人参、喜树和野茶树。荧光定量PCR结果显示,茉莉酸甲酯能诱导白木香AsHMGS的表达。     

鸡Foxp3结构预测及组织表达谱分析

本研究旨在克隆鸡foxp3 (chfoxp3)基因全长编码区序列(coding sequence,CDS),并对其进行生物信息学及组织表达谱分析。以50日龄无特定病原鸡为样本,从脾脏组织中克隆chfoxp3基因全长CDS序列,利用在线工具和软件对chFoxp3进行生物信息学分析,以实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测chfoxp3基因在鸡各组织中的表达分布情况。研究结果表明,chfoxp3基因包含882 bp的开放阅读框,编码293个氨基酸,chFoxp3分子质量为33.44 kDa,属于亲水蛋白;chFoxp3具有Fox转录因子家族典型的forkhead结构域,含有核定位信号;其二级结构由α-螺旋(29.35%)、延伸链(10.92%)、β-转角(5.12%)和无规则卷曲(54.61%)组成;chfoxp3在不同组织中表达有差异,在鸡心脏及胰腺中表达水平较高,显著高于脾脏、法氏囊以及胸腺等免疫器官(P<0.01),这一特点明显区别于哺乳动物;通过系统进化树分析发现,鸡Foxp3与其他野禽属于相同分支,但与哺乳动物相差较远。这些研究结果为进一步深入研究chFoxp3的免疫调节功能奠定了基础。     

沙葱萤叶甲核糖体蛋白基因GdRpS3a的克隆、分子特性及表达分析

核糖体蛋白(ribosomal protein,Rp)是一类参与蛋白质合成、细胞代谢、机体免疫及信号传导等重要功能的蛋白质.本研究旨在克隆沙葱萤叶甲Galeruca daurica核糖体蛋白S3a基因cDNA全长序列,分析其分子特性和表达模式,以期为进一步研究其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用提供必要的基础.根据现有的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了沙葱萤叶甲RpS3a基因的全长cDNA序列,命名为GdRpS3a(GenBank登录号:MN660144).该基因全长为800 bp,开放阅读框全长为687 bp,编码228个氨基酸,具有核糖体蛋白S3a家族的保守功能域;预测分子量为25.63 kDa,等电点pI为10.53,无信号肽和跨膜结构.同源序列比对和系统发育分析表明,GdRpS3a与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera RpS3a的亲缘关系最近,其氨基酸序列一致性最高为54.10％.采用qPCR技术检测该基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段(卵、1～3龄幼虫、预蛹、蛹及成虫羽化3、7、10、15、25、40、60、80和100 d)和3日龄成虫在不同温度(0、5、10、15、20、25、30、35和40℃)处理1h后的表达谱.结果 表明:GdRpS3a在不同发育阶段的沙葱萤叶甲体内均有表达,在成虫滞育结束后表达量最高,在卵期和成虫滞育期间低表达.温度对GdRpS3a的表达有显著的影响,30℃下最高,0℃下最低.GdRps3a的表达与沙葱萤叶甲生长发育阶段及环境温度有关,可能在沙葱萤叶甲成虫夏滞育中起着重要作用.     

血小板生成素基因在NIH/3T3细胞中的表达与调控

应用 Tet- On基因表达系统 ,调控血小板生成素 (TPO)基因在 NIH/3T3细胞中的表达时间与水平 .籍脂质体介导的基因转移方法 ,p Tet- On质粒转染 NIH/3T3细胞株 ,得到稳定细胞株NIH/3T3- Tet- On.p TRE/TPO与 p TK- Hyg质粒共转染 NIH/3T3- Tet- On细胞株 ,得到双稳定细胞株 NIH/3T3- Tet- On- TPO.在培养基中加入或不加强力霉素 ,RT- PCR、Western印迹及 ELISA法检测培养上清 TPO表达 .结果表明 ,当培养基中不加强力霉素时 ,TPO无明显表达 (0 .1 μg/L) ;当培养基中加入 2 mg/L强力霉素时 ,TPO表达明显增高 (1 0 .8μg/L) .TPO表达水平与强力霉素浓度有关 ,随强力霉素浓度增高 ,TPO表达增加 .TPO表达水平还与强力霉素作用时间有关 ,加入强力霉素 6 h后 ,TPO表达明显增加 (1 .2μg/L) ,随培养时间延长 ,TPO表达增加 ,2 4 h达到峰值(1 0 .8μg/L) ,而且这种诱导作用是可逆的 .为进一步进行 TPO基因表达调控的体内研究奠定基础 ,有望为 TPO基因治疗提供一条可控的安全途径     

衣藻叶绿体分裂相关基因CrFtsZ3的克隆及其原核表达

FtsZ蛋白在原核细胞以及植物细胞叶绿体的分裂过程中发挥着重要作用。为了研究叶绿体分裂装置的进化 ,运用RT PCR方法从莱茵衣藻中克隆了叶绿体分裂相关基因CrFtsZ3。由于已经从衣藻细胞中克隆了一个ftsZ基因 ,所以CrFtsZ3的克隆表明衣藻中已经存在两类不同的 ftsZ基因 ,这说明 ftsZ基因的复制与分歧发生于绿藻的分化之前。序列分析结果显示 ,CrFtsZ3所编码的蛋白质具有FtsZ蛋白的典型模体。进一步的原核表达与定位分析表明CrFtsZ3 GFP融合蛋白沿着宿主菌体的纵轴方向有规律地聚集成荧光点或荧光带 ,并且CrFtsZ3蛋白过量表达明显干挠了宿主菌正常的细胞分裂过程 ,说明衣藻CrFtsZ3蛋白能够识别宿主细胞内的分裂位点并影响细胞分裂过程 ,从而初步验证了它的生物学功能     

控制基因盐诱导且根系优势表达的小麦启动子Tasipro3克隆及功能分析

在土壤盐胁迫下,小麦根系吸收水分和营养物质的功能受到抑制,从而影响植株的经济产量。因而,开展小麦耐盐育种,提高根系耐盐性是重要途径之一。使耐盐基因在根系中优势表达,并且在盐胁迫下增强表达,将显著提高根系耐盐性。而克隆和鉴定具有双重控制功能的启动子,是实现耐盐基因精准调控的基础。鉴于此,本研究利用Genevestigator在线生物信息学分析软件,筛选到425个盐诱导根系优势表达的探针,并从中选出2个候选探针,用于启动子验证。以1周龄小麦品种中国春的幼苗为材料,将其根系置于200 mmol/L的NaCl溶液中,分别于0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h和8 h进行根系取样,用于表达模式分析。结果表明,Ta.5463.1.A1_at探针的基因表达模式更符合生物信息学预测的结果,受盐胁迫诱导表达显著上调,且基因优势表达于根系。为进一步验证相应基因启动子的功能,对此探针对应的启动子区进行了克隆,并连接到启动子验证载体中,遗传转化获得转基因拟南芥植株。盐诱导后GUS染色的实验结果表明,该启动子使GUS报告基因在盐处理下表达量显著提高,且主要在根系表达。本研究成功克隆了耐盐遗传改良专用启动子,为小麦分子抗逆育种提供了优异资源。     

丹波黑大豆醛脱氢酶基因GmALDH3-1 的克隆、原核表达和功能分析

醛是一类具有高度反应活性的毒性物质,在生物体中主要由膜脂过氧化,氨基酸氧化和蛋白质的糖基化产生.醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)是一类以多种醛类为底物的酶类,醛脱氢酶基因是一类编码将醛脱氢氧化为相应羧基酸的基因,在植物,动物和微生物中均有发现.通过RT-PCR方法从丹波黑大豆根中扩增出基因GmALDH3-1.构建原核表达载体pGEX-4T-1-ALDH3-1,在E.coli BL21中表达,并研究不同浓度IPTG、时间和温度对ALDH3-1蛋白表达的影响,结果表明28℃下诱导6h ALDH蛋白表达量最大,而IPTG浓度对ALDH3-1的表达量影响不大.在添加有不同浓度Al、Cu和Cd的液体LB培养基中培养转化菌和对照菌,检测转化菌和对照菌的生长曲线,生长曲线实验结果表明ALDH3-1转化工程菌对上述金属离子具有一定的耐受性.这些结果为进一步研究其结构和生物学功能奠定了基础.     

口蹄疫病毒3D蛋白在体外的表达纯化及二级结构分析

口蹄疫(FMD)是严重影响全球农业经济的高度传染的毁灭性的疫病.3D蛋白是口蹄疫病毒(FMDV)编码的RNA聚合酶,参与病毒RNA的复制.利用PCR扩增得到了FMDV的3D基因片段,然后将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)上,构建重组表达质粒pETFM3D.转化宿主菌BL21(DE3)后,利用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE和Western boltting分析结果表明,得到了稳定、过量表达的可溶性的3D蛋白质.目的蛋白质经NI亲和层析柱一步纯化就达到95%,再经Q-sepharose柱纯化后达到97%.通过圆二(CD)色谱测定和计算3D蛋白质在不同的pH(2、4、6、8和10)和不同的温度下(25～85℃)的二级结构.上述结果表明,表达的可溶性3D蛋白质具有高表达、易纯化和稳定性好等特点.     

Cloning and characterization of the gene encoding the highly expressed ribosomal protein l3 of the ciliated protozoan Tetrahymena thermophila. Evidence for differential codon usage in highly expressed genes

We have cloned and characterized the cDNA and the macronuclear genomic copy of the highly conserved ribosomal protein (r-protein) L3 of Tetrahymena thermophila. The r-protein L3 is encoded by a single copy gene interrupted by one intron. The organization of the promoter region exhibits features characteristic of ribosomal protein genes in Tetrahymena. The codon usage of the L3 gene is highly biased. A thorough analysis of codon usage in Tetrahymena genes revealed that genes could be categorized into two classes according to codon usage bias. Class A comprises r-protein genes and a number of other highly expressed genes. Class B comprises weakly expressed genes such as the conjugation induced CnjB and CnjC genes, but surprisingly, this class also contains abundantly expressed genes such as the genes encoding the surface antigens SerH3 and SerH1. Codon usage is slightly more restricted in class A than in class B, but both classes exhibit distinct and different codon usage biases. Class A genes preferentially use C and U in the silent third codon positions, whereas class B genes preferentially use A and U in the silent third codon positions. The analysis suggests that two different strategies have been employed for optimization of codon usage in the A+T-rich genome of Tetrahymena.