β-1,4半乳糖基转移酶-I在大鼠坐骨神经损伤后的表达变化

目的分析β-1,4半乳糖基转移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase I,β-1,4-GalT-I)mRNA在正常和损伤坐骨神经髓鞘上的定位及其表达变化.方法采用RT-PCR方法,分析β-1,4-GalT-I在小鼠坐骨神经中的表达水平.将RT-PCR扩增的β-1,4-GalT-I片段,克隆到pGEM-T载体中.采用体外转录的方法合成地高辛标记的正、反义β-1,4-GalT-I RNA探针.通过原位杂交及图像分析的方法,分析β-1,4-GalT-I mRNA在正常和损伤大鼠坐骨神经的定位及其表达变化.结果检测到β-1,4-GalT-I在大鼠坐骨神经的髓鞘中有表达,并在坐骨神经损伤后1～2d内表达最高,随后表达下降.结论提示β-1,4-GalT-I可能在周围神经最主要的胶质细胞-施万细胞中表达,并在周围神经损伤后发生表达变化,这样为进一步分析β-1,4-GalT-I在周围神经再生中的调控机制奠定基础.     

Tropic 1808基因在大鼠损伤神经组织中的表达

目的观察Tropic 1808基因在大鼠正常和损伤坐骨神经组织中的表达,探讨Tropic 1808基因在周围神经损伤与再生过程中的作用.方法采用地高辛标记的Tropic 1808 cDNA探针、抗大鼠S-100蛋白抗体,以原位杂交和免疫组织化学双重染色法,观察Tropic 1808基因在正常和损伤大鼠坐骨神经组织中的表达.结果免疫组化结果显示,大鼠正常坐骨神经可表达S-100蛋白,但表达量较低;神经损伤后,其远侧端S-100蛋白的表达量明显增加.原位杂交结果显示,大鼠正常坐骨神经组织未见Tropic 1808 mRNA杂交信号;损伤神经的远侧端呈现较强的阳性信号,而且在部分S-100强阳性反应区可见Tropic 1808 mRNA杂交信号.结论 Tropic 1808基因在正常坐骨神经组织中未见表达;坐骨神经损伤后,其远侧端增殖的雪旺氏细胞可表达Tropic 1808 mRNA.提示,Tropic 1808是一种周围神经损伤后特异表达的基因.     

脂多糖干预对大鼠周围神经损伤后瓦勒变性的影响

目的探讨脂多糖对于大鼠坐骨神经损伤瓦勒变性早期髓鞘碎片清除的影响。方法将50只Wistar大鼠随机分成假手术组(10只),模型组(20只)和脂多糖LPS组(20只),LPS组及模型组横断大鼠右侧坐骨神经后,行神经外膜端端吻合;假手术组仅游离出坐骨神经,然后关闭切口。LPS组大鼠在神经断端显微注射LPS(2 g/L)1μL,模型组及假手术组大鼠注射同等体积生理盐水。于术后1.5、24 h和7 d取术侧坐骨神经。实时定量PCR(qRT-PCR)检测坐骨神经中白介素1β(IL-1β)mRNA、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA水平;免疫荧光法检测坐骨神经中CD68+巨噬细胞的表达;HE染色观察坐骨神经的病理变化;油红O染色观察坐骨神经脱髓鞘程度;LFB染色观察坐骨神经髓鞘变化;坐骨神经功能指数(SFI)评价大鼠运动功能的恢复情况。结果实时定量PCR显示,与假手术组相比,术后1.5 h模型组IL-1βmRNA和MCP-1 mRNA的表达均明显升高(P0.001,P0.001),与模型组相比,术后1.5 h LPS组IL-1βmRNA和MCP-1mRNA的表达明显升高(P0.001,P0.001)。术后24 h模型组IL-1βmRNA和MCP-1m RNA的表达均明显升高(P0.001,P0.001),与模型组相比,术后24h LPS组IL-1βmRNA和MCP-1 mRNA的表达明显升高(P0.01,P0.01)。免疫荧光可见,与模型组相比,术后7 d LPS组中CD68+细胞表达显著上调(P0.05)。术后7 d坐骨神经HE染色可见,LPS组坐骨神经断端较多炎性细胞浸润,许旺细胞增殖活跃,模型组神经断端炎性细胞和许旺细胞较少。术后7 d坐骨神经ORO染色可见,与模型组相比,LPS组断端远侧脱髓鞘程度较高。术后7 d坐骨神经LFB染色可见,模型组和LPS组坐骨神经断端均出现脱髓鞘反应,但与模型组相比,LPS组神经断端残余髓鞘碎片明显减少(P0.05)。SFI显示,与模型组相比,LPS组大鼠在术后10、20、30、40和50 d分别不同程度升高,术后20 d明显增高,差异有显著性(P0.05)。结论脂多糖通过激活固有免疫系统加快大鼠坐骨周围神经损伤后瓦勒变性早期髓鞘碎片的清除。     

新生大鼠慢性脑缺血损伤中氯离子通道ClC2的表达及其与白质发育影响作用的研究

目的探讨新生大鼠缺血缺氧损伤后氯离子(Cl-)通道ClC2表达及其阻断剂DIDS对脑白质发育的影响作用。方法采用新生3-5dSD大鼠,以改良Levine法建立慢性脑缺血缺氧模型。运用RT-PCR、活性氧检测和Western Blot检测结合髓鞘卢卡斯快蓝与免疫组织化学染色等技术,对比观察新生缺血缺氧脑损伤前后白质中ClC2的表达变化;分析其与氧化应激、炎症反应的相关性;对比观察损伤前后及损伤后应用DIDS阻断ClC2表达对脑白质髓鞘发育和细胞凋亡的影响。结果1新生缺血缺氧脑损伤后白质中ClC2mRNA和蛋白表达均显著增高(P0.01);伴白质组织活性氧浓度显著升高(P0.01);和iNOS、TNF-αmRNA的表达增加(P0.01)。在胼胝体等白质区髓鞘染色较正常明显浅淡,促凋亡蛋白caspase-3与ClC2阳性双标细胞数目则明显增多(P0.01)。2损伤早期应用DIDS后,ClC2mRNA和蛋白、活性氧浓度、iNOS、TNF-αmRNA的表达以及caspase-3表达等均较损伤组明显降低(P0.05);白质区髓鞘特异染色逐渐加深。结论新生缺血缺氧脑损伤后白质区Cl-通道表达升高与氧化应激、炎症反应呈正相关;可导致由脑白质中caspase-3介导的细胞凋亡增多和髓鞘发育受阻。伤后早期应用DIDS阻断Cl-通道可降低caspase-3介导的凋亡发生,提示早期使用DIDS可部分保护缺血缺氧损伤后的OLs细胞。     

肝组织中NF-κB、TGF-β1及其Ⅰ型受体mRNA和HSC在肝纤维化中的改变及护肝片对其的影响

目的探讨中、晚期纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞(HSC)的活化与增殖、核转录因子-κB(NF-κB)及转化生长因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)表达的改变及护肝片对其的影响。方法采用12.5%CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,自造模之日起,大鼠分组灌胃给药(护肝片921mg/kg)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分别处死动物,取左叶肝组织石蜡包埋,制作组织芯片。免疫组化S-P法检测大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)和NF-κB p65蛋白的表达,原位杂交检测TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达;并用MetaMorph图像分析系统计数-αSMA阳性细胞数,对NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达量进行定量分析。结果 1.模型复制8周和13周,模型组的肝损伤及其纤维化分级均明显高于正常组(P<0.01),护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组。2.模型复制8周和13周,模型组活化的HSC(即-αSMA阳性细胞)数量较正常组明显增多,NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达均较正常组明显增强(P<0.01);3.护肝片显著抑制8、13周纤维化肝组织HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达(P<0.01)。结论抑制HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白与TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达可能是护肝片抗肝纤维化作用的靶点之一。     

骨形态发生蛋白-7及抑制性Smads在糖尿病肾病发生发展中的表达变化

本文采用免疫组化、Western blot及荧光实时定量PCR方法,动态观察链脲佐菌素（streptozocin,STZ）诱导的大鼠糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）发生早期肾脏骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）、Smad6、Smad7蛋白及mRNA表达。结果显示,在正常及DN大鼠肾小管均有BMP-7、Smad6、Smad7蛋白表达,以胞浆表达为主。DN大鼠BMP-7、Smad6蛋白表达较正常大鼠明显增多（P〈0．05）,且BMP-7的mRNA表达呈先增加后降低的状态;而Smad7蛋白和mRNA的表达均呈先增加后降低的状态。转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）及Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ,COL-Ⅰ）mRNA在DN大鼠肾脏表达较正常大鼠明显增多（P〈0．05）,且随着糖尿病进展有逐渐增加的趋势。结果提示,作为TGF-β超家族信号分子的一员,BMP-7信号及抑制性Smad通路在DN肾纤维化发生早期可能起重要的反馈性抑制作用。     

大鼠胰腺发育阶段Mesothelin的表达

目的:研究Mesothenlin在大鼠胰腺发育阶段的表达和细胞定位。方法:运用RT-PCR和Western Blot技术分别检测Mesothenlin在大鼠胰腺发育阶段的mRNA和蛋白表达水平;运用免疫荧光检测不同时期Mesothenlin在胰腺的组织细胞学定位。结果:RT-PCR结果显示E18.5 Mesothelin mRNA的表达水平显著增高,至P14达到高峰,成年较低。Western Blot结果显示其蛋白表达趋势与mRNA完全相同。免疫荧光结果显示在不同发育时期Mesothenlin与胰岛β细胞和间充质细胞共表达。结论:Mesothenlin在大鼠胚胎胰岛形成及生后结构重塑中出现显著性高表达,并表达于胰岛β细胞和间充质细胞。     

周围神经损伤后神经组织中Par-3蛋白表达和分布的变化

目的观察极性蛋白Par-3在损伤后神经组织中的表达和分布,探讨Par-3蛋白在周围神经损伤后髓鞘再生中的作用。方法 32只Sprague Dawley大鼠随机分为正常对照组、损伤组(坐骨神经损伤后第1、2、4、8周)。制备坐骨神经挤压伤模型,分别于损伤后各时间点,采用免疫组织化学法检测坐骨神经损伤远端Par-3蛋白的表达和分布。结果正常大鼠坐骨神经组织中即存在Par-3蛋白,但表达量少,且仅分布于Schwann细胞核内。坐骨神经损伤后,Par-3蛋白的表达和分布发生变化。损伤后1周,Par-3蛋白表达开始升高,Par-3散在分布于Schwann细胞核和细胞浆内。损伤后2周,神经组织中的Par-3蛋白达峰值,在Schwann细胞浆内呈不对称性分布似包绕轴突,呈新月形或C形。损伤后4周和8周,Par-3蛋白表达显著降低,神经组织中Par-3蛋白主要分布于Schwann细胞核内,胞浆内很少。结果 极性蛋白Par-3可能参与周围神经损伤后Schwann细胞的髓鞘再生。     

β-CM7干预对糖尿病大鼠心肌肾素-血管紧张素系统的影响及其保护机制

本文旨在探究β-CM7对糖尿病大鼠心肌组织肾素-血管紧张素系统(Renin angiotensin system,RAS)的影响及其保护机制。32只雄性SD大鼠通过相应处理被分为正常对照组、模型对照组、胰岛素治疗组(3.7×10~(–8) mol/d)及β-CM7干预组(7.5×10~(–8) mol/d)。连续饲养30 d后,处死大鼠取心肌。β-CM7在干预糖尿病模型后,组织中AngⅡ含量显著降低,Ang1-7含量极显著升高;AT1受体和Mas受体mRNA表达均显著升高;ACE和ACE2的mRNA表达均显著升高,且酶活均显著升高。综上可得,β-CM7可以通过激活RAS的负性调节通路"ACE2-Ang1-7-Mas轴"显著抑制大鼠心肌ACE mRNA和蛋白的强表达,缓解AngⅡ对心肌组织的损伤,提示β-CM7抑制心肌损伤的作用可能与ACE/ACE2通路有关。     

白介素-17A在小鼠慢性胰腺炎中的作用研究

目的:研究白细胞介素-17A在小鼠慢性胰腺炎模型中的表达及其对小鼠星状细胞的影响。方法:建立雨蛙肽诱导的小鼠实验性慢性胰腺炎动物模型,利用实时荧光定量PCR、ELISA、免疫组化和Western-blot等手段检测白介素-17A在雨蛙肽诱导的小鼠慢性胰腺炎模型中的表达变化及免疫活性。用重组白介素-17A作用于小鼠胰腺星状细胞,检测其对星状细胞活化的作用,并进一步探究其对促胰腺纤维化炎症因子白介素-6、白介素-1β、TGF-β在mRNA水平的表达变化。结果:慢性胰腺炎胰腺组织中白介素-17A受体IL-17RA及IL-17RC mRNA水平的表达较正常胰腺明显升高,慢性胰腺炎小鼠胰腺组织中IL-17A蛋白水平较正常小鼠明显升高,CP小鼠血清中IL-17A蛋白水平(56.40±10.50 pg/L)较NC组(27.88±5.74pg/L)亦明显升高,IL-17A在正常胰腺组织中鲜有表达(8.9±2.72%),而在CP组织中呈强阳性表达(55.84±5.71%),其免疫活性主要定位于间质炎性细胞及导管样复合体中;重组白介素-17A可促进小鼠星状细胞活化,并直接诱导星状细胞表达白介素-6、白介素-1β以及TGF-β等促纤维化细胞因子。结论:白介素-17A在雨蛙肽诱导的小鼠慢性胰腺炎模型中表达上调,并可能通过诱导小鼠星状细胞表达促炎细胞因子白介素-6、白介素-1β和TGF-β,促进胰腺星状细胞活化以及胰腺纤维化。     

气道平滑肌细胞Ryanodine受体亚型mRNA的表达及其在哮喘中的变化

目的:测定正常大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)中Ryanodine受体(Ryanodine receptor RyR)各亚型mRNA的表达以及在哮喘中的变化.方法:采用胶原酶消化法培养大鼠ASMCs,RT-PCR测定受体各亚型mRNA的表达.卵蛋白致敏并激发大鼠制备慢性哮喘模型,RT-PCR测定各受体mRNA表达水平的变化.结果:大鼠ASMCs中可见RyR1、RyR2和RyR3三种RyR亚型mRNA共表达,扩增片段测序结果与GenBank中登录的大鼠RyR1-3序列完全一致.制备的慢性哮喘模型中,病理切片显示平滑肌层及黏膜层明显增厚,RyR1的表达较对照组有明显的上调P＜0.05.结论:大鼠气道平滑肌细胞中RyR三种亚型共表达,提示存在着复杂的细胞内钙调节机制;并且RyR1在慢性哮喘的发生过程中可能起了一定的作用.     

转化生长因子-β1及Sirt1/2参与高血压诱导的血管平滑肌细胞缝隙连接蛋白-43的表达及细胞增殖

为探讨转化生长因子-β1及组蛋白去乙酰化酶Sirt1和Sirt2在高血压诱导的血管平滑肌细胞缝隙连接蛋白-43表达及细胞增殖中的作用,研究了腹主动脉窄缩诱导高血压大鼠和正常大鼠胸主动脉转化生长因子-β1、缝隙连接蛋白-43、Sirt1和Sirt2,以及细胞增殖标志蛋白增殖细胞核抗原表达的变化;观察Sirt1和Sirt2在转化生长因子-β1刺激大鼠VSMCs缝隙连接蛋白-43的表达及细胞增殖中的作用。结果显示,高血压大鼠胸主动脉的转化生长因子-β1、缝隙连接蛋白-43、TGF-β1、Sirt1和Sirt2的表达及细胞增殖较正常大鼠均明显升高;转化生长因子-β1促进了大鼠血管平滑肌细胞缝隙连接蛋白-43的表达和增殖,Sirt1与Sirt2的抑制剂Salermide有效抑制了转化生长因子-β1诱导的血管平滑肌细胞缝隙连接蛋白-43的表达与细胞增殖。结果表明,高血压通过上调转化生长因子-β1来诱导VSMCs缝隙连接蛋白-43的表达和细胞增殖,而Sirt1和Sirt2可能在其中起调控作用。     

细叶远志皂苷在Aβ23-35诱导SH-SY5Y 细胞氧化损伤中的作用及机制研究

为研究细叶远志皂苷(tenuifolin,TEN)在Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤中的作用,并探讨其作用机制。建立Aβ25-35诱导的细胞损伤模型,细叶远志皂苷以及自噬抑制剂3-MA进行干预,显微镜观察细胞形态变化,试剂盒检测细胞氧化应激水平,RT-qPCR和Westernblot检测细叶远志皂苷以及自噬抑制剂干预前后Beclin-1、LC3、mTOR、AMPK和ULK1mRNA及蛋白水平变化。结果发现,TEN改善Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞形态损伤和细胞活力下降;降低ROS和MDA浓度,并提高SOD、GSH-Px及过氧化氢酶的活性;增加AMPK和ULK1的表达,减少mTOR的表达及增加Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平。而加入3-MA会拮抗TEN的作用。总之,TEN可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路,增加Beclin-1及LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白水平激活自噬,进而改善Aβ25-35诱导的细胞形态损伤和细胞活力下降,提高细胞抗氧化应激能力,发挥神经保护作用。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因克隆表达及其抗菌活性与机理研究进展

β-1,3．1,4-葡聚糖酶是一类能水解β-1,3．糖苷键和β-1,4-糖苷键的酶,因其主要分解大麦中的β-1,3-1,4-葡聚糖和细菌地衣多糖,所以又称地衣多糖酶。综述了β-1,3．1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达及其抗菌活性与机理最新研究进展。     

大鼠肝纤维化组织中TGF-β1的研究

目的 观察转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在大鼠肝纤维化组织中的动态表达,探讨TGF-β1在肝纤维化中的意义.方法 采用腹腔内注射二甲基亚硝胺(DMN)构建大鼠肝纤维化模型,造模后4天、1周、2周、4周、6周、8周分别检测血清ALT、AST、ALB的变化,同时取肝组织用半定量RT-PCR方法检测TGF-β1 mRNA的表达.采用HE染色及Masson三色染色,光学显微镜下观察肝组织损伤情况.采用单因素方差分析进行多组均数间的比较.结果 肝纤维化模型组血清ALT、AST明显升高,ALB明显下降.TGF-β1 mRNA在对照组大鼠和肝纤维化模型组大鼠肝组织中均有表达.与对照组相比,肝纤维化模型组4天～1周时,TGF-β1 mRNA表达差异无统计学意义(P均＞0.05).2～4周较对照组显著升高(P均＜0.05),4周时达高峰.6～8周较4周时显著下降(P均＜0.05),但仍显著高于对照组(P均＜0.05).8周较6周时下降,差异无统计学意义(P＞0.05).TGF-β1 mRNA表达与肝纤维化病程呈正相关(P＜0.01).结论 TGF-β1 mRNA在正常SD大鼠肝脏中有表达,在肝纤维化大鼠肝组织中表达增加,与大鼠肝脏病理分期正相关.     

HSC的活化、增殖与TGF-β1及其Ⅰ型受体在中晚期纤维化肝组织中的改变及护杆片对其的影响

目的 探讨护肝片对中、晚期纤维化大鼠肝组织肝星状细胞(HSC)的活化与增殖及转化生长因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)表达的影响.方法 采用12.5% CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,自造模之日起,大鼠分组灌胃给药(护肝片921mg·kg-1)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分别处死动物,取左叶肝组织石蜡包埋,制作组织芯片,免疫组化S-P法检测大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1及TβRⅠ蛋白的表达,并用MetaMorph图像分析系统计数α-SMA阳性细胞数、对TGF-β1及TβRⅠ蛋白表达量进行定量分析.结果 1.模型复制8周和13周,模型组的肝损伤及其纤维化分级均明显高于正常组(P＜0.01),护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组.2.模型复制8周和13周,模型组活化的HSC(即α-SMA阳性细胞)数量较正常组明显增多、TGF-β1及TβRⅠ蛋白的表达较正常组明显增强(P＜0.01);3.护肝片显著抑制8、13周纤维化肝组织HSC的活化与增殖和TGF-β1及TβRⅠ蛋白的表达(P＜0.01).结论 抑制HSC的活化与增殖和TGF-β1及TβRⅠ的表达可能是护肝片抗肝纤维化作用的靶点之一.     

周围神经43kD蛋白免疫化学研究

目的：制图周围神经43kD蛋白单克隆抗体,并检测该蛋白在正常及损伤坐骨神经中的表达,方法：实验用SDS－聚丙烯酰胺胺凝胶电泳系统,从周围神经中分离回收43kD蛋白作为抗原,免疫BALB／c小鼠,通过杂交瘤技术和点膜印迹法检测,获得分泌识别43kD蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以Westernblot方法检测单克隆抗体的特异性,并检测43kD蛋白在正常坐骨神经及损伤坐骨神经远侧端中的表达。结果：经检测获得了识别43kD蛋白的单克隆抗体,Westernblot显示在正常大鼠坐骨神经与损伤后2周的坐骨神经远侧端组织电泳图谱43kD处均出现特异的阳性反应条带,在损伤神经中43kD蛋白阳性反应产物着色较深。结论：43kD蛋白具有独特的免疫化学特性,在正常与损伤坐骨神经中的有表达,在损伤坐骨神经中表达更强。     

神经再生过程中脊髓运动神经元β管蛋白基因表达的变化

损伤大鼠右侧坐骨神经后,SDS—PAGE电泳分析双侧腹角细胞中蛋白含量变化,发现损伤侧的管蛋白相对含量较对照侧增加了17％—121％。损伤后3—14d损伤侧腹角运动神经元中β管蛋白mRNA的原位杂交信号增强了27％—70％,β管蛋白mRNA的Northern杂交分析也显示基因表达的增强。     

全脑缺血/再灌注大鼠海马PPARγ mRNA表达变化

目的 观察大鼠全脑缺血/再灌注损伤后海马PPARγ mRNA表达的动态变化.方法 采用夹闭双侧颈总动脉,颈总静脉抽血后回输建立大鼠全脑缺血/再灌注损伤模型.Morris水迷宫检测大鼠空间定向能力变化,HE染色观察海马病理组织学改变及RT-PCR法检测缺血再灌注后不同时间点PPARγ mRNA的表达变化.结果 全脑缺血/再灌注损伤导致大鼠空间学习及记忆能力明显下降,海马神经元出现明显的核固缩和细胞丢失.PPARγ mRNA的表达先升高后降低,以缺血/再灌注后48 h表达水平最高,30 d后接近正常水平.结论 全脑缺血/再灌注损伤大鼠海马组织中PPARγ mRNA的表达,在再灌注30 d内明显增加,表达高峰在48 h.