提高大豆根瘤菌质粒稳定性的研究

以发光酶基因luxAB作为报告基因,将广谱稳定性质 粒pTR102的parCBA/DE基因导入含37kb增效片段的pLARF3并去除该质粒的cos序列,构建成重组质粒pHN115和pHN156。同时,构建只带有cos序列和luxAB的参比质粒pHN157和pHN158。将上述4种质粒通过三亲本杂交分别导入费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiu m fredii) HN01,将pHN155和pHN158通过两亲本杂交分别导入大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)TA11,在人工继代培养条件下比较测定其质粒保持率。结果表明;经连续转接培养7次后,pHN155、pHN156、pHN157和pHN158在HN01中的质粒保持率分 别为100%、67%、72%和92% 。连续转接培养4次后,pHN155和pHN158在TA11中的质粒保持率分别为98%和92%。说明parCBA/DE基因能显著提高质粒在快、慢生型大豆根瘤菌中的遗传稳定性,cos序列的去除也有一定的作用。     

以绿色荧光蛋白为报告基因的原核启动子检测体系构建

以质粒pMUTIN-GFP 扩增获得的目的gfp 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBE2-GFP .将组成型启动子P43和诱导型启动子Pspac克隆入pBE2-GFP ,得到重组表达载体pBE-GFP-P43和pBE-GFP-Pspac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.荧光显微镜检测GFP 蛋白的表达情况.结果 表明,2种不同类型的启动子均能在大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌1A751中启动gfp 基因的表达.     

小麦叶绿体基因组定点整合表达载体的构建

从小麦中分别克隆了包括rbcL基因3′端部分和完整的psaI、ycf4基因的DNA片段.利用克隆到的DNA片段作为同源重组片段、烟草叶绿体16S rRNA基因的启动子Prrn和PsbA基因的终止子PsbA3′控制筛选标记基因aadA和报告基因gfp的转录,构建了小麦叶绿体基因组定点整合表达载体pRAGY. 用该载体转化大肠杆菌,在激光扫描共聚焦显微镜下,检测到了gfp基因成功表达的产物被激发出的强烈的绿色荧光.     

构建LEF1基因毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞

旨在构建内蒙古白绒山羊(Capra hircus)淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因真核表达载体并转染胎儿成纤维细胞,获得稳定表达红色荧光蛋白及毛囊特异性表达LEF1的转基因细胞克隆。以pCDsRed2载体为基本骨架将LEF1基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,连接红色荧光蛋白表达元件,构建LEF1基因毛囊特异表达载体pCDsRed-KL。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KL序列中,LEF1基因正确连接在KAP6-1启动子下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为14.0%,经G418筛选得到高效表达红色荧光蛋白转基因细胞克隆。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和LEF1基因整合到胎儿成纤维细胞基因组中。     

鼠伤寒沙门菌pagC启动子的克隆与活性分析

从鼠伤寒沙门菌中克隆出pagC启动子(PpagC),构建体内激活的表达质粒pZW,插入庚型肝炎病毒（HGV）NS3基因,构建出表达质粒pZWNS3。以其转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,观察PpagC的启动活性。结果表明：Mg2+可抑制PpagC的启动活性,Mg2+浓度小于50mmol/L时培养的重组菌经SDSPAGE和Western blot检测能高水平表达HGV NS3蛋白。Mg2+浓度升至50mmol/L时,NS3蛋白表达量明显降低。收集以50mmol/L Mg2+的培养基扩增的重组菌,灌胃接种C57小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果显示PpagC是一个强的宿主体内激活的启动子,为构建以伤寒沙门氏菌为载体的高效免疫口服疫苗提供了一个新的途径。     

马立克氏病病毒pp38基因和1.8kb转录子之间双向启动子的特性研究

从马立克氏病病毒(MDV)基因组DNA复制原点区某一点,将介于MDV pp38基因和18kb转录子之间的双向启动子分割成两个单方向的启动子。以pp38为报告基因,pUC18质粒为载体,构建了含不同方向完整启动子序列的pProfpp38和 pProrpp38质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfpp38和pdProrpp38质粒。4种质粒分别转染鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast, CEF）后,均能检测到pp38基因的表达。进一步以氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol acetyltransferase, CAT）为报告基因,构建了含不同方向完整双向启动子的pProfCAT和 pProrCAT质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfCAT和 pdProrCAT质粒。通过转染试验,定量分析了完整启动子和分割后启动子在两个方向上的启动活性。实验结果表明,分割后的启动子在两个方向上的启动活性均比相应方向上完整启动子的活性低,其中1.8kb转录子方向上的活性下降了41倍。     

费氏中华根瘤菌腺嘌呤缺陷突变株的构建与筛选

构建出费氏中华根瘤菌嘌呤合成酶基因purL的基因置换载体pHN701,purL内部NotⅠXhoⅠ片段被luxAB基因取代,造成正常基因的破坏。用该载体对野生型费氏中华根瘤菌HH103进行purL的基因置换,筛选到腺嘌呤缺陷型突变株P825。波动实验和连续转接试验结果表明该突变菌株表型十分稳定。purL表达载体pBBRPG在P825中可恢复其在基本培养基上的生长情况,证明突变株确实为purL单基因破坏。盆栽结瘤实验结果表明,该突变株只能侵染大豆根系形成不固氮的根瘤。     

杂合抗菌肽CecA_mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达

参照毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）偏好密码子,改造并化学合成杂合抗菌肽CecA_mil基因,改造后的CecA_mil基因克隆到pPICZα_A载体中,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα_A_CM,转化Pichia pastoris受体菌X_33。在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1.9 kD的CecA_mil杂合抗菌肽获得表达,经表达条件优化,重组酵母菌的摇瓶发酵产率可达到245μg/mL。抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G－菌及G＋菌均有较好的抑菌活性,特别是对氨苄青霉素抗性菌和卡那霉素抗性菌抑杀效果更好;具有热稳定性和酸稳定性。这些特点使得重组抗菌肽CecA_mil在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

LCB1基因表达对酵母神经酰胺合成的影响

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LCB1（Long chain base）基因被克隆到酵母诱导表达载体pYES2中,并转入到FY2中,用半乳糖诱导表达。与对照相比,质粒所含LCB1基因的表达,使酵母细胞干重略有下降,而神经酰胺的含量提高为对照的1.9倍。     

假单胞菌M18转录调节因子σS基因与无启动子lacZ 基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern 杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β半乳糖苷酶基因（′lacZ）插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18 rpoS基因突变株M18SZ。 Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定（OD600）的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。     

导入额外拷贝nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮作用的影响

以广宿主、稳定性质粒pTR102为载体构建重组质粒pHN306,其上克隆有来自肺炎克氏杆菌（Klebsiellapneumoniae）的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶标记基因（luxAB）。经三亲本接合转移,将pHN306导入费氏中华根瘤菌（Sinorhizobiumfredii）HN01,GR3和YC4。与出发菌相比较的盆栽试验结果表明：HN01（pHN306）和GR3（pHN306）分别在大豆渝豆一号和黑龙33上能显著提高瘤数,瘤重,植株地上部分干重和总氮量,YC4（pHN306）在大豆渝豆一号上也能显著提高瘤数,癌重和总氮量,对植株地上部分干重表现出一定的促进作用。结果表明：nifA基因对固氮效率和结瘤能力的促进作用与受体根瘤菌和大豆品种等因素有关。以luxAB为报告基因进行的菌落和根瘤发光检测结果表明：pHN306可在供试根瘤菌中稳定遗传。     

紫云英根瘤菌由种子浸提物诱导的基因调控片段的克隆和分析

The large plasmids of strain 7653R were digested with restriction enzyme EcoRI. Their DNA fragments were cloned into the expression vector pMP220 to construct a lacZ fusion pool, which were transferred into the recipient strain 7653R Tri-transconjugants were selected onto plates containing X-gal and seed extract Five blue colonies were assayed of their β-galactosidase activity after incubation with or without seed extract. A positive induced strain HN18 was obtained. Hybridization of nodDABC probe on the re…     

导入dctABD和nifA基因对费氏中华根瘤菌共生固氮的影响研究

以pTR102为载体构建重组质粒pHN307,其上克隆有来自昔蓿中华根瘤菌（Sinorthizobium meliloti）的四碳二羧酸转移酶基因dctABD、来自肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae）的nifA基因和来自pDB30所含的发光酶基因lux-AB。经三亲本接合转移,将pHN307导入费氏中华根瘤菌（S.fredii)NH01、YC4和GR3,并考察了转移接合子中pHN307在传代培养和共生条件下的稳定性。与出发菌相比较的植物盆栽试验结果表明,在与大豆黑农33共生时,导入pHN307后的转移接合子均可显著提高结瘤植株的瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量。在与大豆川早一号共生时,转移接合子HN01（pHN307）可显著提高结瘤植株的瘤数和瘤重;GR3（pHN307）可显著提高结瘤植株的瘤数、瘤重、地上部分干重和地上部分总氮量;导入pHN307的YC4却呈现出负作用。本研究表明,导入dctABD可提高固氮效率     

Stable transformation of the gram-positive phytopathogenic bacterium Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with several cloning vectors.

In this paper we describe transformation of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, the potato ring rot bacterium, with plasmid vectors. Three of the plasmids used, pDM100, pDM302, and pDM306, contain the origin of replication from pCM1, a native plasmid of C. michiganensis subsp. michiganensis. We constructed two new cloning vectors, pHN205 and pHN216, by using the origin of replication of pCM2, another native plasmid of C. michiganensis subsp. michiganensis. Plasmids pDM302, pHN205, and pHN216 were stably maintained without antibiotic selection in various strains of C. michiganensis subsp. sepedonicus. We observed that for a single plasmid, different strains of C. michiganensis subsp. sepedonicus showed significantly different transformation efficiencies. We also found unexplained strain-to-strain differences in stability with various plasmid constructions containing different arrangements of antibiotic resistance genes and origins of replication. We examined the effect of a number of factors on transformation efficiency. The best transformation efficiencies were obtained when C. michiganensis subsp. sepedonicus cells were grown on DM agar plates, harvested during the early exponential growth phase, and used fresh (without freezing) for electroporation. The maximal transformation efficiency obtained was 4.6 x 10(4) CFU/microgram of pHN216 plasmid DNA. To demonstrate the utility of this transformation system, we cloned a beta-1,4-endoglucanase-encoding gene from C. michiganensis subsp. sepedonicus into pHN216. When this construction, pHN216:C8, was electroporated into competent cells of a cellulase-deficient mutant, it restored cellulase production to almost wild-type levels.     

导入dctABD和parCBA／DE基因提高大豆慢生根瘤菌固氮皎效率和稳定？…

以ｐＬＡＦＲ３为载体构建重组质粒ｐＨＮ２０７,携带有来自苜蓿根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）的四碳二羧酸转移酶基因ｄｃｔＡＢＤ、来自ｐＴＲ１０２的ｐａｒＣＢＦＡ／ＤＥ基因和标记发光酶基因ｌｕｘＡＢ。利用２亲本杂交法,将重组质粒ｐＨＮ２０７导入大豆慢生根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＴＡ１１和ＣＢ１８０９,分别考察了转移接合子中外源重组质粒在人工培养条     

小鼠脂联素与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

以绿色荧光蛋白(GFP)基因(gfp)为报告基因,构建小鼠脂联素(mADPN)基因(mAd)与gfp的融合基因mAd/gfp表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd-gfp,脂质体法转染体外培养的COS-7细胞,荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达可间接反映mADPN的表达,并通过RT-PCR在核酸水平进一步确证mAd的表达.荧光显微镜观察及RT-PCR结果均证明mADPN在COS-7细胞中获得了高效表达,表明mADPN重组表达载体pCI-neo-apoEHCR-hAATp-mAd可以在真核细胞COS-7中高效表达mADPN,为进一步探讨mAd在小鼠体内的表达提供了可行性依据.     

导入dctABD和parCBA／DE基因提高大豆慢生根瘤菌固氮效率和稳定性的研究

以pLAFR3为载体构建重组质粒pHN207,携带有来自苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的四碳二羧酸转移酶基因dctABD、来自pTR102的parCBA／DE基因和标记发光酶基因luxAB。利用2亲本杂交法,将重组质粒pHN207导入大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）TA11和CB1809,分别考察了转移接合子中外源重组质粒在人工培养条件和共生条件下的稳定性,结果表明par基因的引入明显提高pLAFR3在TA11和CB1809中的稳定性。dctABD基因可显著提高TA11和CB1809在大豆黑龙33、宁镇一号和渝豆一号上的共生固氮能力,使结瘤植物的地上部分干重（生物量）和总氮量等指标较对照组有显著提高。     

灰树花gpd-Gf启动子的功能分析

利用从灰树花菌丝体中克隆的gpd-Gf（615bp）启动子片段串联于报告基因gfp上游,构建启动子功能活性检测表达质粒pGg-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pGg-gfp与辅助质粒pCc1001（含有trp1基因）共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测, 结果表明：灰树花gpd-Gf启动子在灰盖鬼伞菌丝中具有较强驱动gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下可以观察到转化子菌丝发出的强烈荧光。