痢疾志贺菌A1型IroN, ShuA单、双突变体的构建及功能分析

本研究构建了痢疾志贺菌A1型SD51197株IroN及ShuA基因缺失及插入的单、双基因突变体MTS-1、MTS-2、MTS。对各突变体在培养基、细胞水平进行了功能检测,并利用SD51197全基因组芯片对各突变株进行了铁丰富和铁限制条件下的表达谱分析。结果显示,在添加铁螯合剂DIP条件下,各突变株生长水平都明显低于野生株,补加铁离子可以使突变株回复到正常生长水平;在HeLa细胞和U937细胞的胞内存活增殖和胞间扩散能力实验中,各突变株的生长状态都没有明显变化,但在HeLa细胞侵袭过程中添加DIP,MTS-1、MTS-2、MTS的胞内存活增殖能力与野生株相比分别下降了23.4%、25.2%、43.6%。铁限制条件下的表达谱结果表明,各突变株对缺铁的变化比野生株更敏感,多个基因的表达发生改变,上调基因主要涉及转录、辅酶代谢、氨基酸代谢和功能未分类基因,而下调基因主要包括能量代谢和碳水化合物代谢以及功能未分类的基因;已知的转铁相关基因普遍上调。此结果表明运铁相关基因IroN、ShuA可能影响着志贺氏菌的生长和毒力。     

补料培养提高真养产碱杆菌产3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚物生产强度的研究

对Alcaligenes eutrophus进行高密度培养,研究表明在发酵过程中进行有效控制,可以较大幅度地提高3－羟基丁酸和3－羟基戊酸共聚物[P(3HB-co-3HV)]的生产强度。实验中选择使用限氮的方法积累P(3HB-co-3HV),分别采用丙酸和戊酸为3HV前体,对摇瓶种子生长状态,停氮时机对菌体生产P(3HB-co-3HV)的影响以及补酸（3HV前体）策略进行了研究,在6．6L罐中,以葡萄糖为碳源,以丙酸为3HV前体培养50h,细胞干重,PHA产量,PHA含量分别达到149．9g/L,149.9g/L,83.3%(其中3HV组分占PHA的12．4mol%),生产强度达到2．50（g.h^-1.L^-1);以戊酸为3HV前体培养45h,细胞干重,PHA产量,PHA含量分别达到160．2g/L,119.0g/L,74.2%（其中3HV组分占PHA的17．7mol%)生产强度达到2．64（g.h^-1.L^-1)。     

补料培养提高真养产碱杆菌产3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚物生产强度的研究

对Alcaligeneseutrophus进行高密度培养 ,研究表明在发酵过程中进行有效控制 ,可以较大幅度地提高 3-羟基丁酸和 3 羟基戊酸共聚物 [P(3HB-co-3HV) ]的生产强度。实验中选择使用限氮的方法积累P(3HB-co-3HV) ,分别采用丙酸和戊酸为 3HV前体 ,对摇瓶种子生长状态 ,停氮时机对菌体生产P(3HB-co-3HV)的影响以及补酸 (3HV前体 )策略进行了研究 ,在 6.6L罐中 ,以葡萄糖为碳源 ,以丙酸为 3HV前体培养 5 0h ,细胞干重 ,PHA产量 ,PHA含量分别达到 149.9g L ,12.49g L ,83.3% (其中 3HV组分占PHA的 12 4mol% ) ,生产强度达到 2.50 (g·h^-1·L^-1) ;以戊酸为3HV前体培养 45h ,细胞干重 ,PHA产量 ,PHA含量分别达到 16.02g L、119 0g L、74.2 % (其中 3HV组分占PHA的17.7mol% ) ,生产强度达到 2.64(g·h^-1·L^-1)     

福氏2a志贺氏菌sitC插入突变体的构建、检测及微阵列分析

针对在低拷贝自杀质粒pCVD442中难以进行基因操作的缺陷,本研究将Gateway技术应用在了基因敲除前期的重组质粒构建过程。应用这一改进的系统构建了福氏2a志贺氏菌301株转铁相关基因sitC的插入突变体MTS。对突变体分别在培养基、细胞和动物实验水平进行了功能检测,并利用芯片技术进行了限铁条件下突变体和野生型菌株的表达谱比较。结果显示,添加150 µM铁螯合剂DIP（2,2’-dipyridyl）条件下,MTS生长水平明显低于野生株,补加铁离子或锰离子可使突变株生长回复到丰富培养基条件下的生长水平;在HeLa细胞和U937细胞的胞内存活增殖能力和胞间扩散能力以及豚鼠角膜结膜炎实验中,MTS没有显现出明显的毒力改变,但在HeLa细胞侵袭过程中添加65 µM的DIP,MTS的胞内存活增殖能力和Sf301相比下降了51.6%。限铁条件下的表达谱结果表明,整体上MTS对缺铁变化比Sf301更敏感,上调的基因比野生株多106个,主要涉及膜转运、氨基酸代谢和功能未分类基因,而下调基因中参与能量代谢和碳水化合物代谢的较多。缺铁条件下,已知的转铁相关基因普遍上调,且MTS中上调的基因数目及上调幅度要高于Sf301。此结果再次证实了Sit铁转运系统对志贺氏菌生长的重要性。     

提高大豆根瘤菌质粒稳定性的研究

以发光酶基因luxAB作为报告基因,将广谱稳定性质 粒pTR102的parCBA/DE基因导入含37kb增效片段的pLARF3并去除该质粒的cos序列,构建成重组质粒pHN115和pHN156。同时,构建只带有cos序列和luxAB的参比质粒pHN157和pHN158。将上述4种质粒通过三亲本杂交分别导入费氏中华根瘤菌(Sinorhizobiu m fredii) HN01,将pHN155和pHN158通过两亲本杂交分别导入大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)TA11,在人工继代培养条件下比较测定其质粒保持率。结果表明;经连续转接培养7次后,pHN155、pHN156、pHN157和pHN158在HN01中的质粒保持率分 别为100%、67%、72%和92% 。连续转接培养4次后,pHN155和pHN158在TA11中的质粒保持率分别为98%和92%。说明parCBA/DE基因能显著提高质粒在快、慢生型大豆根瘤菌中的遗传稳定性,cos序列的去除也有一定的作用。     

导入dctABD和parCBA／DE基因提高大豆慢生根瘤菌固氮效率和稳定性的研究

以pLAFR3为载体构建重组质粒pHN207,携带有来自苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的四碳二羧酸转移酶基因dctABD、来自pTR102的parCBA／DE基因和标记发光酶基因luxAB。利用2亲本杂交法,将重组质粒pHN207导入大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）TA11和CB1809,分别考察了转移接合子中外源重组质粒在人工培养条件和共生条件下的稳定性,结果表明par基因的引入明显提高pLAFR3在TA11和CB1809中的稳定性。dctABD基因可显著提高TA11和CB1809在大豆黑龙33、宁镇一号和渝豆一号上的共生固氮能力,使结瘤植物的地上部分干重（生物量）和总氮量等指标较对照组有显著提高。     

一种从感染的培养细胞中分离细菌RNA的方法

病原菌全基因组表达谱研究是阐明其致病机理的必要的基础 ,已经成为当前生命科学领域的热点和重点 ;然而由于难于从感染的组织中快速固定并分离细菌RNA ,从而极大的制约了该研究的进展。介绍一种从感染的细胞中分离细菌RNA的方法———冷酸酚法 ,其主要特点是 :(1)使用可以破碎真核细胞但不影响细菌细胞完整性的SDS浓度 ,实现了从感染的细胞中快速分离完整的细菌 ,减少了宿主细胞RNA的污染 ;(2 )在将细菌从细胞中分离的同时即利用苯酚 乙醇混合液将其总RNA快速固定 ,既减少了RNA的降解 ,又最大限度地保持了细菌在哺乳细胞内原有的表达模式 ;(3)可以从 10 8个菌体中提取到至少 30 μg的总RNA ,足够用于反转录等其他研究。该方法将为利用DNAMicroarray技术进行的病原菌表达谱研究提供有益的借鉴。