传染性支气管炎病毒江苏分离株核蛋白基因序列测定与同源性分析

将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株JS／95／03接种鸡胚,分离、纯化病毒,提取单股RNA做为反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物,使用单管RT－PCR方法,物异扩增IBV核蛋白（N）基因5'端854bp的片段,扩增产物纯化后测,序列分析表明,IBV N基因也存在较大变异,此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性最高。     

中国1995～1999年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995~1999年10株IBV现地分离株的核蛋白基因片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析。结果发现,10株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1 230bp的ORF,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失。与GenBank中的20个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的毒株主要分布于3个群中,该3群病毒主要包括我国IBV现地分离株。对n基因及其局部功能区序列比较发现,我国分离株与H120疫苗株N蛋白存在广泛的氨基酸变异。通过与s1基因系统发育进化树比较发现,我国IBV分离株存在基因重组现象。以上结果表明我国1995~1999年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。     

一株鸭源传染性支气管炎病毒的分离鉴定及结构蛋白基因和血清型分析

【目的】对从广西某鸭场发生呼吸道感染的11天龄樱桃谷肉鸭分离到的病毒株进行鉴定,并探索此鸭源病毒分离株的遗传变异情况。【方法】通过血凝试验、鸡胚接种实验、3?端非编码区(3'UTR)基因扩增与序列测定对分离株进行鉴定,并对该分离株的结构基因S1、E、M和N分别进行序列测定以及相似性、系统进化树分析和血清型鉴定。【结果】血凝试验为阴性,接种鸡胚盲传5代后出现侏儒胚,3?UTR基因测序结果表明为传染性支气管炎病毒(IBV)序列。该分离株S蛋白的裂解位点为RRSRR,S1、E、M和N基因与IBV毒株H120、4/91、LTD3核苷酸相似性分别为:78.6%–99.7%、85.4%–100.0%、91.6%–93.2%、86.7%–91.7%。除N基因存在点突变外,S1、E和M基因均存在氨基酸的突变、插入和(或)缺失。系统进化树分析显示,其S1基因属于4/91型,E、M和N基因均为LDT3型。血清型分析表明,该分离株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。【结论】此鸭源病毒分离株为IBV,且该分离株的基因型与血清型均发生了变异。本研究结果暗示禽类传染性支气管炎的防控面临着更严峻的挑战。     

小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白基因序列分析

目的了解广东地区小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）的分子遗传特征和进化来源。方法采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7%~100%和94.8%~100%之间,15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5%~92.9%和92.4%~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。     

我国2002−2016年间鸡传染性支气管炎病毒基因组序列重组分析

【目的】传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)主要引起鸡群呼吸道与肾脏疾病,是影响养禽业重要的病毒性病原之一。了解我国IBV的流行及基因重组情况。【方法】收集GenBank中我国2002?2016年间分离的92株IBV S1基因及55株IBV基因组序列,并对这些序列进行比对分析。【结果】IBV S1基因序列分析结果表明,2002?2016年间我国流行的92株IBV可以分为13个基因型,包括QX、4/91、Mass、tl/CH/LDT3/03、CK/CH/LSC/99I、TW-I、TW-II、TC07-2、Ck/CH/LDL/97I、N1/62-associated、Arkansas、New-I及一个新鉴定的基因分支New-II。值得注意的是,属于美国相关基因分支的ck/CH/LSD/110712已在我国出现。RDP4方法进行重组分析显示,新出现的基因分支New-II病毒S1基因来源于tl/CH/LDT3/03型与QX型毒株重组,我国2002?2016年间流行的55株IBV中有52株IBV基因组存在重组事件,其中25个IBV分离株基因组中发现有疫苗型(Mass,tl/CH/LDT3/03及4/91型等)病毒基因组片段的重组,这一结果在SimPlot分析中进一步得到确认。【结论】根据生物信息学分析结果,证明流行于我国的IBV基因型众多,疫苗毒株基因频繁参与了IBV基因重组,导致IBV新的基因型或变异株出现,提示在防控IB时要注意合理使用IBV疫苗。     

广西不同时期IBV分离株S1基因高变区Ⅰ的遗传变异分析

对广西1985-2007年间分离到的22株传染性支气管炎病毒（IBV）的S1基因高变区I（HVRI）进行序列测定,并与发表的其他IBV参考株及鸽子分离的冠状病毒株的基因序列进行比较和分析。系统进化关系显示毒株可分为5个基因群,其中有16个广西分离株属第1群,它们与鸽子冠状病毒分离株的氨基酸序列同源性较高,与Massachusetts（Mass）型疫苗株的同源性较低。有15个分离株在33-34位和34～35之间分别有4个和3个氨基酸残基的插入,GX-NN6在33～34位和34～35位之间则均有4个氨基酸残基的插入;GX-YL1、GX-NN2与常用的Mass型疫苗株的亲缘关系最近,同属于第Ⅱ群;GX-G、GX-XD与日本同一时期分离的毒株JP Miyazaki 89亲缘关系最近,属于第Ⅲ群;GX-YL6、GX-NN7与欧洲毒株4／91亲缘关系较近,属于第V群。结果表明广西存在着多种类型IBV毒株的流行,毒株S1基因HVRI碱基的突变或插入比较普遍,可导致其氨基酸序列的变化,绝大部分毒株与目前常用的Mass型疫苗株的亲缘关系较低。同一时期的分离株同源性较高,但无明显的地域性差异。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株（793／B）核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析。结果表明,IBV793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失。N基因的核苷酸同源性为86.9%～91.4%,氨基酸同源性为75.8%～77.5%。表明IBV93/B的N基因存在着较大的变异性。     

陕西省9株乙脑病毒的分离及E基因序列分析

分析陕西省分离的9株乙脑病毒基因组序列特征。使用乙脑病毒全基因组序列测定引物进行RT-PCR扩增,扩增产物进行测序,拼接后获得基因组序列。利用MEGA 4.1、MegAlin、MEGA7.0等软件进行毒株的系统进化分析,并与P3株、减毒活疫苗SA14-14-2株及覆盖5个基因型别的其他乙脑病毒进行E基因序列比对。9株分离株3株分离自猪舍、6株分离自羊舍,其中4株获得全基因组序列,5株测得E基因序列。基于E基因序列进行毒株核苷酸、氨基酸同源性比较,结果显示分离株均与基因I型GI-b亚型毒株核苷酸和氨基酸同源性最高,核苷酸同源性范围为96.5%～99.7%、氨基酸同源性范围99.2%～100.0%;与SA14-14-2株核苷酸同源性范围为87.5%～88.9%、氨基酸同源性范围96.3%～97.2%;与P3株核苷酸同源性范围为87.6%～88.1%、氨基酸同源性范围96.7%～97.6%。分析09年（陕南地区）分离株与18年（关中地区）分离株的E基因核苷酸差异率为1.8%～2.9%、氨基酸差异率为0%～0.8%。陕西省自然界中循环的乙脑病毒以基因Ⅰ型为主,与P3株在抗原毒力关键位点无差异,...     

鸡传染性支气管炎病毒变异株(793/B)核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV 793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析.结果表明,IBV 793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV 793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失.N基因的核苷酸同源性为86.9%～91.4%,氨基酸同源性为75.8%～77.5%.表明IBV 93/B的N基因存在着较大的变异性.     

中国1995～2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995～2004年20株IBV现地分离株的膜蛋白(Membrane,M)基因片段.序列测定表明,20株IBV分离株M基因开放阅读框由672～681bp组成,编码由223～226个氨基酸残基组成的多肽.与我国分离株LX4相比,M基因推导氨基酸序列的变异主要发生在2～17位、221～223位,其中4～6位存在氨基酸的插入和缺失,导致IBV毒株间M蛋白糖基化位点的差异.与GenBank中34株IBV参考毒株M蛋白基因推导氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示54株IBV毒株分属于5个进化群.我国IBV分离株M基因在进化关系上较为独立,主要分布在第Ⅱ群和第Ⅳ群,其中第Ⅱ群分离株和中国台湾毒株进化关系密切.此外,参考IBV国内分离株S1基因及N基因系统发育进化树的研究结果,并与M基因进行比较,表明我国IBV也存在着基因重组现象,尤其是疫苗毒和流行毒之间的重组.     

鸽源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救

参照GenBank上公布的鸽源Ⅵb亚型新城疫病毒JS/07/04/Pi株基因组全序列设计9对引物,RT-PCR扩增目的片段后,依次亚克隆至TVT7/R转录载体,成功构建出含JS/07/04/Pi株基因组全长cDNA的转录载体TVT/071204。然后将其与三个辅助表达质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L共转染BSR-T7/5细胞,60h后将转染细胞及其上清接种鸡胚,收集死亡鸡胚尿囊液进行HA与HI试验。结果显示死亡鸡胚尿囊液HA呈阳性,并能被ND阳性血清所抑制,表明该病毒已成功拯救,且拯救病毒rNDV/071204在细胞上的生长增殖能力同母本病毒相似。该病毒的成功拯救为鸽源Ⅵb亚型NDV感染的宿主特异性及鸽用ND新型疫苗的研究提供了理想的生物材料。     

鸡传染性支气管炎病毒两个地方分离株S1基因的扩增克隆与序列分析

对IBV肾型毒株JS/95 /0 3和呼吸型毒株SD/97/0 1的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定 ,将两毒株的S1基因序列与 10个参考毒株进行了比较。结果表明 ,JS/95 /0 3和SD/97/0 1分别与M41和H12 0株亲缘关系最近 ,它们可能是疫苗毒株的变异株。JS/95 /0 3和SD/97/0 1间的亲缘关系也较近 ,两者S1蛋白中只有 2 4个氨基酸的差异 ,其中有 15个位于前 130个氨基酸中 ,第 116位氨基酸可能与毒株的致病性有关。对两毒株S1蛋白的二级结构进行了预测和比较 ,结果发现 ,一个或极少数氨基酸的差异即可导致S1蛋白二级结构和抗原性的改变     

A recombinant avian infectious bronchitis virus expressing a heterologous spike gene belonging to the 4/91 serotype

We have shown previously that replacement of the spike (S) gene of the apathogenic IBV strain Beau-R with that from the pathogenic strain of the same serotype, M41, resulted in an apathogenic virus, BeauR-M41(S), that conferred protection against challenge with M41. We have constructed a recombinant IBV, BeauR-4/91(S), with the genetic backbone of Beau-R but expressing the spike protein of the pathogenic IBV strain 4/91(UK), which belongs to a different serogroup as Beaudette or M41. Similar to our previous findings with BeauR-M41(S), clinical signs observations showed that the S gene of the pathogenic 4/91 virus did not confer pathogenicity to the rIBV BeauR-4/91(S). Furthermore, protection studies showed there was homologous protection; BeauR-4/91(S) conferred protection against challenge with wild type 4/91 virus as shown by the absence of clinical signs, IBV RNA assessed by qRT-PCR and the fact that no virus was isolated from tracheas removed from birds primarily infected with BeauR-4/91(S) and challenged with IBV 4/91(UK). A degree of heterologous protection against M41 challenge was observed, albeit at a lower level.Our results confirm and extend our previous findings and conclusions that swapping of the ectodomain of the S protein is a precise and effective way of generating genetically defined candidate IBV vaccines.     

猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性

从黑龙江省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以RT-PCR法扩增出猪流行性腹泻病毒M基因后,采用细胞培养法进行病毒分离。对细胞培养分离物进行间接免疫荧光、免疫电镜观察、RT-PCR及ELISA法检验,其中间接免疫荧光试验可见培养细胞中存在明显的特异性绿色荧光;免疫电镜下可见大小符合预期、有囊膜、花瓣状的典型冠状病毒结构特征;RT-PCR检测证实存在PEDVM基因;间接ELISA检测中平均P/N比值为7.6;从而确认为分离到一株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),命名为PEDVLJB/03株。随后,对该分离毒株的培养特性及如何提高病毒滴度进行探索。通过摸索该分离毒株的蚀斑形成条件,建立了PEDV蚀斑形成方法,并采用该方法进行病毒的蚀斑纯化,纯化得到PEDV大蚀斑克隆株和小蚀斑克隆株。对大、小两种蚀斑克隆株的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑克隆株细胞感染滴度相差明显。     

IBV核蛋白的表达纯化及在监测中应用

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是禽类一种变异性很强的冠状病毒,为获得高度纯化的IBV核蛋白,建立监测IBV抗体的方法,通过RT-PCR从IBV中扩增IBV-N基因,定向连接到表达载体pGEX-KG中,转化E. coli BL21（DE3）菌株,诱导获得表达产物,SDS-PAGE分析产物大小、Western blot分析其免疫学活性,通过亲和层析法获得高度纯化的表达蛋白,建立一种检测IBV抗体的方法,并应用于临床监测。结果显示,IBV-N基因全长1230bp,GST融合蛋白表达产物大小约为80kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%,具有良好的免疫学活性;通过GST亲和层析柱成功获得纯化蛋白,以该蛋白包被酶标板,成功地建立了一种检测血清中IBV抗体的间接ELISA方法。研究表明重组N蛋白作为IBV诊断抗原,具有制备简便、特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于该病的临床监测,为该病疫情监测、发病机制研究奠定了基础。     

B型流感病毒B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株的遗传进化及其对小鼠的致病性分析北大核心CSCD

B型流感病毒(influenza B virus,IBV)比A型流感病毒(influenza A virus,IAV)更易引发并发症,在一定季节内造成的疾病负担甚至超过IAV,但目前人们对IBV的关注较少。为了分析IBV临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018的遗传进化特点,本研究构建了系统进化树,并以世界卫生组织推荐的疫苗株为参考,对其血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)进行了氨基酸序列同源性及突变位点分析。分析结果发现B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株无谱系间重配现象,与同年疫苗株B/Colorado/06/2017匹配性较差。另外,测定了B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株感染小鼠的半数致死量(median lethal dose,LD_(50))及其对小鼠的致病性。结果表明,B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018毒株感染小鼠的LD_(50)为10^(5.9) TCID_(50)(median tissue culture infective dose),小鼠肺脏中病毒滴度在感染后1 d达到高峰,炎性细胞因子的mRNA水平在感染后12 h达到高峰,且感染后肺脏中的肺泡损伤严重,有大量炎性细胞浸润。本研究证明了IBV临床毒株B/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018可以感染小鼠并诱发典型的肺脏炎症,为研究IBV致病及传播机制奠定了基础,为评价新型流感疫苗、抗病毒和抗炎症药物提供了理想的动物模型。     

猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株S基因的克隆、序列分析及线性抗原表位区的鉴定

以猪流行性腹泻病毒CH/JL毒株的RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得的3个相互重叠的cDNA克隆覆盖了S基因,序列比对结果表明:PEDV CH/JL株S基因与CV777、Brl/87、JS、KPEDV和Chinju99毒株S基因核苷酸序列的同源性分别为96.97%、96.87%、96.41%、94.02%和93.93%,氨基酸序列的同源性分别为96.17%、95.88%、96.10%、92.36%和92.05%;分子进化树分析结果显示,PEDV CH/JL株S基因与JS毒株S基因亲缘关系最近,处于同一群。利用DNAstar Protean程序预测了PEDV CH/JL株S蛋白一个抗原表位区(83~276aa),将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,在终浓度1.0mmol/L的IPTG诱导下获得了表达,Western blot结果显示,预测的抗原表位区GST融合蛋白能与猪流行性腹泻病毒多克隆抗血清反应,提示该抗原表位区含有线性抗原表位。     

Development and characterization of a recombinant infectious bronchitis virus expressing the ectodomain region of S1 gene of H120 strain

Infectious bronchitis (IB), caused by infectious bronchitis virus (IBV), is a highly contagious chicken disease, and can lead to serious economic losses in poultry enterprises. The continual introduction of new IBV serotypes requires alternative strategies for the production of timely and safe vaccines against the emergence of variants. Modification of the IBV genome using reverse genetics is one way to generate recombinant IBVs as the candidates of new IBV vaccines. In this study, the recombinant IBV is developed by replacing the ectodomain region of the S1 gene of the IBV Beaudette strain with the corresponding fragment from H120 strain, designated as rBeau-H120(S1e). In Vero cells, the virus proliferates as its parental virus and can cause syncytium formation. The peak titer would reach 10^5.9 50 % (median) tissue culture infective dose/mL at 24 h post-infection. After inoculation of chickens with the recombinant virus, it demonstrated that rBeau-H120(S1e) remained nonpathogenic and was restricted in its replication in vivo. Protection studies showed that vaccination with rBeau-H120 (S1e) at 7-day after hatch provided 80 % rate of immune protection against challenge with 10³ 50 % embryos infection dose of the virulent IBV M41 strain. These results indicate that rBeau-H120 (S1e) has the potential to be an alternative vaccine against IBV based on excellent propagation property and immunogenicity. This finding might help in providing further information that replacement of the ectodomain fragment of the IBV Beaudette S1 gene with that from a present field strain is promising for IBV vaccine development.     

The Replicase Gene of Avian Coronavirus Infectious Bronchitis Virus Is a Determinant of Pathogenicity

We have previously demonstrated that the replacement of the S gene from an avirulent strain (Beaudette) of infectious bronchitis virus (IBV) with an S gene from a virulent strain (M41) resulted in a recombinant virus (BeauR-M41(S)) with the in vitro cell tropism of the virulent virus but that was still avirulent. In order to investigate whether any of the other structural or accessory genes played a role in pathogenicity we have now replaced these from the Beaudette strain with those from M41. The recombinant IBV was in effect a chimaeric virus with the replicase gene derived from Beaudette and the rest of the genome from M41. This demonstrated that it is possible to exchange a large region of the IBV genome, approximately 8.4 kb, using our transient dominant selection method. Recovery of a viable recombinant IBV also demonstrated that it is possible to interchange a complete replicase gene as we had in effect replaced the M41 replicase gene with the Beaudette derived gene. Analysis of the chimaeric virus showed that it was avirulent indicating that none of the structural or accessory genes derived from a virulent isolate of IBV were able to restore virulence and that therefore, the loss of virulence associated with the Beaudette strain resides in the replicase gene.