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1.
猪伪狂犬病病毒流行株HLJ-01的分离鉴定及致病性分析   总被引:1,自引:1,他引:0  
【背景】自2011年以来,猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)发生变异,经典的疫苗株已不能完全抵抗PRV变异株的感染,国内多个猪场出现伪狂犬病的暴发,PRV变异毒株开始在我国大规模流行。【目的】通过分离PRV流行变异毒株,并对其进行遗传进化和致病性分析,为PRV流行病学调查及疫苗研制提供实验数据。【方法】采集黑龙江某猪场感染PRV的脑组织病料,根据GenBank PRV gEgB保守序列设计引物,进行PCR鉴定。通过对gEgC基因进行序列测定和遗传进化分析。利用BHK-21细胞分离病毒,采用噬斑纯化方法对病毒进行纯化。通过电镜、间接免疫荧光对病毒进行鉴定,测定病毒生长曲线并进行致病性研究。【结果】经PCR和测序鉴定分离株为PRV流行株,将其命名为HLJ-01。遗传进化分析结果显示,该分离毒株与我国近几年分离的流行变异株位于同一分支;氨基酸序列分析结果显示,gE和gC存在国内流行变异株的特征序列,表明该分离毒株为流行变异株。生长曲线显示,分离株HLJ-01在感染48h时滴度最高(108.5TCID50/mL)。电镜观察结果显示,病毒颗粒直径约150nm,呈球形,有囊膜,囊膜外有放射状纤突,呈现典型PRV病毒特征。动物感染实验结果显示,107.0TCID50剂量感染组死亡率为100%;106.0TCID50剂量感染组死亡率为80%;105.0TCID50剂量感染组死亡率为60%。仔猪在接种病毒后均出现PRV感染的典型症状和病理变化,证实分离毒株对仔猪有较强致病力。【结论】分离获得一株猪伪狂犬病毒,经鉴定该分离株为流行变异株,而且具有较强的致病力,这为PRV流行病学分析及疫苗候选株的筛选奠定了基础。  相似文献   
2.
猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性   总被引:2,自引:0,他引:2  
从黑龙江省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以RT-PCR法扩增出猪流行性腹泻病毒M基因后,采用细胞培养法进行病毒分离。对细胞培养分离物进行间接免疫荧光、免疫电镜观察、RT-PCR及ELISA法检验,其中间接免疫荧光试验可见培养细胞中存在明显的特异性绿色荧光;免疫电镜下可见大小符合预期、有囊膜、花瓣状的典型冠状病毒结构特征;RT-PCR检测证实存在PEDVM基因;间接ELISA检测中平均P/N比值为7.6;从而确认为分离到一株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),命名为PEDVLJB/03株。随后,对该分离毒株的培养特性及如何提高病毒滴度进行探索。通过摸索该分离毒株的蚀斑形成条件,建立了PEDV蚀斑形成方法,并采用该方法进行病毒的蚀斑纯化,纯化得到PEDV大蚀斑克隆株和小蚀斑克隆株。对大、小两种蚀斑克隆株的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑克隆株细胞感染滴度相差明显。  相似文献   
3.
为探讨表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白(N)基因的重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠后诱导特异性免疫应答,本研究制备表达流行性腹泻病毒核蛋白的重组干酪乳杆菌,应用Western blotting、间接免疫荧光和全细胞ELISA鉴定目的蛋白的表达。然后用该重组干酪乳杆菌口服免疫BALB/c小鼠,分别测定了免疫后不同时间血清中特异性IgG、粪便中特异性的sIgA水平以及血清的中和活性;并测定免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和细胞因子水平。结果显示,目的蛋白表达在细胞表面,可被阳性血清所识别。免疫小鼠后,可分别在血清中和粪便中检测到较高水平特异性IgG、sIgA(P<0.01),但血清并没有中和活性;淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定结果显示,免疫组可产生明显的细胞免疫应答。结果表明,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生黏膜免疫应答和系统免疫应答,具有作为口服疫苗潜在的应用价值。  相似文献   
4.
牛乳铁蛋白肽是由牛乳铁蛋白经消化酶水解产生的一类具有广谱抑菌活性的短肽;乳酸乳球菌作为食品级微生物,既有天然的益生作用,又是理想的表达牛乳铁蛋白肽的载体。【目的】探究重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363表达牛乳铁蛋白肽的抑菌活性。【方法】利用牛乳铁蛋白肽标准品绘制定量标准曲线来确定重组牛乳铁蛋白肽的含量,利用牛津杯法及微量肉汤稀释法测定重组牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等35株细菌的抑菌活性及最小抑菌浓度,利用扫描电镜、透射电镜、荧光显微镜、凝胶阻滞试验、黏附试验来探究重组牛乳铁蛋白肽对菌体结构、细菌DNA及黏附力的影响,利用CCK-8检测其对RAW 264.7细胞的毒性作用,并对小鼠红细胞溶血率进行测定。【结果】重组乳酸乳球菌上清中牛乳铁蛋白肽的浓度为24.39μg/mL,重组牛乳铁蛋白肽对测试的25株致病菌均有不同程度的抑制作用,抑菌浓度范围在16–128μg/mL,但对9株乳酸菌以及粪肠球菌没有明显的抑制作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、鸡白痢沙门菌的菌体完整性具有不同程度的破坏作用,其主要作用靶点为细菌的细胞膜,可以与细菌DNA结合并抑制细菌对Caco-2、IPEC细胞的黏附作用,重组牛乳铁蛋白肽对小鼠红细胞及RAW 264.7细胞没有明显的细胞毒性。【结论】乳酸乳球菌表达重组牛乳铁蛋白肽的抑菌活性与牛乳铁蛋白肽标准品相一致,通过直接作用于细菌细胞膜、胞内核酸或抑制细菌对正常细胞的黏附作用等多方面实现抑制或杀死细菌,发挥广谱的抗菌活性,且对真核细胞没有明显的细胞毒性作用。  相似文献   
5.
为了在乳酸乳球菌中分泌表达具有生物活性的猪IL-18蛋白,并检测其生物活性,故通过分离猪外周血单核淋巴细胞(PBMC),以其为模板,采用RT-PCR方法扩增猪白细胞介素18(pIL-18)基因,将目的基因与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,通过SDS-PAGE和Western blotting分析检测目的蛋白的表达,并通过脾淋巴细胞增殖试验和细胞病变抑制法对pIL-18的生物活性进行检测。Western blotting分析检测结果与生物活性检测结果显示,在重组菌pAMJ399-pIL18/MG1363的上清和菌体沉淀中19 kDa处均出现pIL-18的特异蛋白反应带,且分泌表达的pIL-18蛋白能明显促进猪脾淋巴细胞的增殖,并对病毒增殖有明显的抑制作用。以上结果表明pIL-18可在乳酸乳球菌分泌表达,且表达产物具有良好的生物活性。  相似文献   
6.
蓝舌病病毒4型特异性竞争ELISA检测方法的建立   总被引:2,自引:0,他引:2       下载免费PDF全文
旨在建立蓝舌病病毒4型(BTV-4)特异性抗体ELISA检测方法,为蓝舌病的免疫学诊断提供新的技术。利用制备的两株抗4型BTV VP2蛋白的单克隆抗体4A-1G7和4B-1B6,建立BTV-4特异性竞争ELISA抗体检测方法。利用该方法同时对50份羊和牛BTV阴性血清进行检测,分别确定两种方法阻断率临界值为49%和40%。利用标准阳性血清检测的试验结果表明,该方法的敏感性、特异性和重复性符合OIE通用标准。同时,4A-1G7和4B-1B6两种竞争ELISA方法联合作用,可以检测感染4、18和20型BTV的血清。研究结果为建立以上各型BTV的检测方法提供了基础。  相似文献   
7.
将分别编码猪细小病毒(PPV)主要免疫保护性抗原VP2蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入乳酸杆菌细胞表面表达载体pPG中, 成功构建了重组表达载体pPG-VP2-LTB, 将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393, 获得了表达猪细小病毒VP2-LTB融合蛋白的重组乳酸菌表达系统, 经2%乳糖诱导, SDS-PAGE和Western-blot检测表明, 有大小约78 kD的蛋白得到了表达, 具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性, 全细胞ELISA结果表明, LTB同  相似文献   
8.
为研究本实验室制备的一株抗蓝舌病病毒8型(BTV-8)VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)3G11识别的B细胞抗原表位,利用噬菌体肽库展示技术对3G11识别的抗原表位进行筛选并鉴定。经过4轮淘选后挑取蓝斑测序,测序结果经分析后获得KLLAT序列,与BTV-8 VP2蛋白氨基酸序列比对后获得共同的短肽序列为283LL284;合成4种短肽序列:KLLAA、KALAT、KLAAT和KLLAT,与3G11细胞上清和腹水分别进行间接ELISA鉴定,结果表明,短肽KLLAA和KLLAT与3G11细胞上清及腹水具有较强的结合能力;与24种BTV标准阳性血清反应结果表明,这两种短肽都可与BTV-8阳性血清发生特异性反应;序列分析结果可见,该表位的氨基酸序列283LL284在不同来源的BTV-8毒株间保守,确定283LL284为MAb3G11识别抗原表位的关键氨基酸。本研究为建立8型BTV特异性的免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。  相似文献   
9.
重组猪乳铁蛋白N端的高效表达及抑菌活性检测   总被引:1,自引:0,他引:1  
为获得表达猪乳铁蛋白基因的重组菌株,并检测其表达的重组猪乳铁蛋白抑菌活性,应用RT-PCR方法从泌乳3d后母猪乳腺组织中扩增了猪乳铁蛋白N端1077bp的PLF-N基因片段,与GenBank上发表的4株猪乳铁蛋白基因序列相比,核苷酸同源性均达到99%以上。为了得到高表达量的PLF-N基因,以扩增的PLF-N片段为参考模板,经过密码子优化,全基因合成了编码猪乳铁蛋白N端的基因PLF-NS。将其定向插入到原核表达载体pET-30b中,转化大肠杆菌BL21,获得了表达PLF-NS的重组菌pET-PLF-NS/BL21;经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,以及通过SDS-PAGE和Western blotting分析均表明猪乳铁蛋白得到了正确表达,其产物分子量约为42kDa,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的32%,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经裂解、纯化、复性处理后纯度达到98%。用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明重组猪乳铁蛋白具有明显的抑菌作用。表明通过基因优化对表达量低的基因进行改造使之高效表达,是一种提高表达效率的有效手段。  相似文献   
10.
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