基因枪轰击成熟花粉粒转化玉米的研究

利用基因枪轰击花粉粒再授粉的基因转化途径,将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（CpTI）成功导入玉米受体中。经卡那霉素筛选结果表明,非转化植株经1000ppm卡那霉素溶液处理后白化、死亡,余下大量健壮、可育的抗性植株,转化率约1．59％。通过对抗性植株进行PCR和PCR—Southern检测,初步确定CpTI基因已导入玉米基因组。饲虫实验结果表明转化植株具有较强的抗虫性。     

基因枪介导的大蒜遗传转化体系的建立

以大蒜无菌苗根诱导的愈伤组织为受体进行基因枪转化,根据愈伤组织的形态特征设计了6组基因枪转化参数进行试验。结果表明,其中4组转化试验都获得了转基因植株;轰击距离9 cm、压力1100 psi和轰击距离12.5 cm、压力1300 psi各轰击1次的轰击方式获得了最高的转化效率,为2.4%。对抗性植株进行了PCR和Southern blot检测,证明pCAMBIA1301载体上的潮霉素抗性选择标记基因和gus报告基因已整合到抗性植株的基因组中。对转化后的愈伤组织、胚状体、根、再生芽尖和叶片进行gus基因的表达检测,抗性材料显示出明显的蓝色反应。这些结果表明已初步建立了基因枪介导的大蒜遗传转化体系,将为大蒜的基因工程改良奠定基础。     

影响草地早熟禾（Poa pratensis L.）基因枪转化关键因素研究

将含有DREB1A基因的表达载体,通过基因枪法转化草地早熟禾的胚性愈伤组织,探讨了金粉沉淀剂、金粉直径等因素对转化的影响,同时通过不同浓度潮霉素（Hygromycin,简称Hy）对未转化愈伤组织的筛选,获得最佳筛选浓度。结果表明,适合于草地早熟禾基因枪轰击的条件为：Ca（NO3）2＋PEG4000包被质粒DNA;1μm金粉作为质粒DNA的载体;合适的轰击高度为6cm、轰击次数为1次、无渗透处理。采用Hy作为草地早熟禾转基因植株抗生素筛选标记时,Baron品种愈伤组织继代的临界筛选浓度为100mg/L。     

微藻高效基因枪转化方法的建立

基因枪法是外源基因导入微藻细胞的重要手段。然而,发展至今,微藻细胞基因枪转化效率一直偏低（10~50个转化子/μg DNA）,高价低效的转化方法阻碍了基于高通量转化子的基因功能分析。为了提高基因枪的转化效率,本研究以三角褐指藻为材料,从抗生素选择培养基的改良,微载体的选择、制备、包埋、点膜和轰击参数的优化,以及受体细胞的处理等方面进行了系统研究。结果显示,采用50%海水盐度f/2培养基可以提高博来霉素的效价,f/2固体培养基中2216E营养物质的加入能缩短1/3的平板筛选时间。微载体制备应选择对金（钨）粉没有吸附作用的离心管,制备量/管应少于3.5 mg。微载体轰击量每次大约为0.75 mg,过量将会造成一个轰击死亡圈,过少将导致轰击成本上升。当轰击间距A为6.35 mm,间距B为11 mm,间距C为6 cm时,可以获得最多的转化细胞。109个受体细胞铺成较厚的多细胞层能显著提高转化效率。经过上述优化与改进,本研究将现有文献报道的转化效率提高了4.7~30倍,达到295 ± 60个转化子/μg DNA。该方法除适用于三角褐指藻外,也可广泛应用于其他微藻（杜氏盐藻、小球藻）的基因枪转化研究,可以为微藻基因工程研究提供快速,高效和可靠的操作技术。     

可育的抗除草剂溴苯腈转基因小麦

报道了采用微粒轰击（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍ ｂａｒｄｍ ｅｎｔ） 幼胚将除草剂抗性基因导入小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）的转化研究。实验共使用了１３ 个小麦品种, 从开花后１４～１８ ｄ 的籽粒中剥取幼胚, 植物表达质粒含有ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子控制的除草剂溴苯腈抗性基因ｂｘｎ 以及筛选标记基因ＮＴＰⅡ。采用高压放电基因枪,用质粒ＤＮＡ 包被的钨粒轰击预培养３ ｄ 的幼胚。在含有卡那霉素类似物ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ４１８ｓｕｌｐｈａｔｅ 的ＭＳ培养基上, 经过多步骤筛选和分化, 从８００ 多个幼胚中获得了１６ 株转化苗。除草剂抗性鉴定和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分析证明, 其中４ 株为转基因植物,具有溴苯腈抗性, 并且自交可育。转化工作从分离幼胚到转化苗鉴定完毕, 最短时间为６ 个月, 因此, 该方法是一项快速有效的基因导入技术     

多年生黑麦草成熟胚再生体系的建立及基因枪转化

目的:建立以多年生黑麦草成熟胚为起始材料的再生体系,用于基因枪转化。方法:多年生黑麦草成熟种子在附加 5mg L 2,4 D的MS培养基上诱导愈伤组织,转至新继代培养基上产生胚性愈伤组织。分化培养基为无激素MS培养基。再生植株在培养基成分减半的无激素MS培养基生根,之后移栽至土壤。基于这一再生体系,用含有水稻几丁质酶基因RC2 4的质粒pARN6和含有草丁膦乙酰转移酶基因Bar的质粒pDB1,通过基因枪轰击胚性愈伤组织。用附加PPT的继代培养基进行转化植株的抗性筛选。结果:共获得 2 4 3株再生植株。通过PCR进行检测,获得1 8株整合有RC2 4基因的植株,1 5株整合有Bar基因的植株,同时转入 2个基因的植株 2株。     

利用微束激光穿刺法将抗真菌基因导入棉花的研究初报

以棉花感受态萌动种胚作为外源基因转化的受体,用激光微束穿刺法将β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶双价基因导入棉花,所构建的植物表达载体pB IBGC携带有筛选标记npt-Ⅱ(新霉素磷酸转移酶)基因。激光转化处理的种胚经卡那霉素筛选,已经获得抗性小植株。研究了微束激光转化法用于棉花感受态萌动胚转化预培养的时间、高渗液对材料的处理等。研究表明:用微束激光转化处理种胚是一种操作简便、重复性好的转化方法,用该法可将外源基因导入植物感受态萌动胚,避开植株离体再生的困难。     

基因枪介导甘蔗遗传转化几个影响因素的研究

用基因枪GJ1000介导将Bt基因转入甘蔗嫩叶、Ⅰ型愈伤组织和Ⅱ型愈伤组织。结果表明,用Ⅱ型愈伤组织作为受体最用利于转化;气体压力、轰击距离、轰击次数和真空度对转化效率有不同程度的影响。条件优化后,得到了大量的抗性愈伤组织和一些抗性植株,转化率分别为34.9％和3.36％。     

基因枪介导小麦遗传转化的几个重要影响因素的研究

用基因枪将携带gus-bar双标记基因的质粒pDB1及携带RC24几丁质酶基因的质粒pARN6、pBAB3、pYAO24(pYAO24还带有nptⅠ选择标记基因)以pARN6 pDB1、pBAB3 pDB1及pYAO24三种组合方式转入8个小麦品种的未成熟胚盾片组织,经选择培养获得转基因植株。对基因枪介导小麦遗传转化的主要影响因素,如基因型、材料、金粒制备和轰击参数进行分析,发现西农88是理想的转基因受体基因型,开花两周后的小麦幼胚为理想的轰击材料,制备子弹时合适的金粒含量为30～50pg／次,充分混匀金粒悬浮液可以减少幼胚损伤和提高转化频率。GUS染色发现以蔗糖为渗透剂所产生的蓝色斑点比以甘露醇为渗透剂所产生的蓝色斑点大。针对载体上的nptⅠ筛选标记基因,150mg／L的硫酸卡那霉素为较理想的选择剂浓度;针对载体上的bar筛选标记基因,PPT的浓度为2mg／L易出现假阳性植株,因此应将浓度增加到3～5mg／L。     

基因枪法获得GAI转基因橡胶植株的研究

将含有Camv35S启动子、卡那霉素抗性基因和GUS报告基因,目的基因为GAI基因的转化载体质粒pBI121,通过基因枪轰击巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell-Arg.)花药愈伤组织,50 mg L~(-1)卡那霉素的继代培养基进行抗性筛选.获得了抗性再生植株,经过PCR、Southern检测结果表明:GAI基因已经成功转入橡胶树基因组中.     

基因枪法获得GAI转基因橡胶树植株的研究

将含有Camv35S启动子、卡那霉素抗性基因和GUS报告基因,目的基因为GAI基因的转化载体质粒pBI121,通过基因枪轰击巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell-Arg.)花药愈伤组织,50 mg L~(-1)卡那霉素的继代培养基进行抗性筛选.获得了抗性再生植株,经过PCR、Southern检测结果表明:GAI基因已经成功转入橡胶树基因组中.     

PEG法介导转化诸葛菜下胚轴原生质体获得转基因植株

采用诸葛菜无菌苗的下胚轴组织为材料,分离原生质体,在原生质体培养基中作液体浅层暗培养,植板率为５％,植株再生频率为１００％。作者进而开展了遗传转化研究。为研究ＰＥＧ介导转化诸葛菜原生质体的影响因素,通过瞬间表达,实验了ＰＥＧ法转化子叶原生质体的过程,在此基础上将分离纯化后的原生质体与带ＨＰＴ基因的质粒ＤＮＡ（ｐＢＩ２２２）混合,ＨＰＴ基因作选择标记,ＰＥＧ介导转化;重新收集转化后的原生质体,以５×１０４／ｍｌ的密度在原生质体培养基中作浅层培养;培养１０—１５天后用２５ｍｇ／Ｌ的潮霉素（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）进行筛选,一月后出现少量细胞团,转入含潮霉素５０ｍｇ／Ｌ的扩增培养基扩增愈伤组织,进而转入含５０—１００ｍｇ／Ｌ潮霉素的分化培养基诱导分化成苗,分化率为１００％,转入生根培养基中生根成完整植株。抗性植株再生率为４×１０（－５）。在获得再生转基因植株后,以再生植株叶片为材料,进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分子杂交,证实外源基因已稳定整合到植物基因组中并表达,再生转基因植株频率为１０（－５）。国内外首次转化诸葛菜属植物原生质体获得成功。     

基因枪法获得转cry1Ac基因甘蔗的研究

根据定向克隆原则,以pGreenⅡ0229为载体骨架,cry1Ac为目的基因,bar为筛选标记基因,构建了大小为8602 bp的植物表达载体pUBCG0229-cry1Ac。酶切结果表明,构建的载体pUBCG0229-cry1Ac结构完全正确。用基因枪轰击法将pUBCG0229-cry1Ac质粒DNA转化甘蔗(Saccharum Complex)品种福农95-1702和桂糖94-119的胚性愈伤组织,使用PPT(phosphinothricin)对轰击后的材料进行继代、分化和生根筛选,移栽成活后使用Basta溶液喷洒进行初步筛选,共获得86株抗性植株,通过PCR检测、Dot-Southern检测及PCR产物测序,证明已将cry1Ac基因整合到其中22株甘蔗基因组中。     

以耐草甘膦2mG2-epsps基因为选择标记的玉米转化体系的建立

转化细胞的筛选和再生是植物遗传转化体系中重要的组成部分,筛选剂的选择和筛选压力的高低直接影响着外源基因的转化率。以草甘膦异丙胺盐为筛选剂,通过比较在不同的草甘膦浓度及筛选时间的条件下,玉米愈伤组织生长和分化情况,发现经1mM的草甘膦异丙胺盐筛选15d后玉米愈伤组织分化受到明显抑制,故以此作为玉米遗传转化实验中的筛选压力。通过基因枪轰击,将构建好的pMAGUHM载体（其上携带有抗草甘膦基因2mG2-epsps基因）转化到玉米愈伤组织,利用草甘膦筛选得到耐草甘膦植株80株,其中PCR检测阳性植株为36株,转化率为45％。     

兰州百合基因枪转化方法的研究

以兰州百合试管苗鳞片叶为受体,通过基因枪转化法将脱氢抗坏血酸还原酶基因(DHAR)转入兰州百合,并用GUS染色、PCR扩增和Southern杂交等技术进行转基因株系的检测.结果表明:以兰州百合鳞片叶为受体材料,在轰击压力1 100 psi、轰击距离6 cm时,抗性率高达14%,转化率为1.5%;10 mg/L的潮霉素对鳞片叶具有很好筛选作用.GUS分析发现,转化株系叶片为蓝色;PCR检测和Southern杂交进一步证实抗性株系为转基因植株,且为单拷贝.     

乙肝病毒表面抗原基因在胡萝卜中的克隆及表达

构建HBV表达抗原（HBsAg)植物表达载体并在胡萝卜植株中表达。采用自行构建adr亚型HBsAg基因克隆T-adr,再次酶切获得860bp含PreS2的HBsAg基因片段,将其插入到植物表达载体pBPC55,新质粒命名为pBPC91adr。将其与含除草剂抗性基因及GUS蛋白基因的筛选质粒pBPC93共同经基因枪（PDS-1000/He)转化胡萝卜悬浮细胞,经含除草剂（Biolaphos)的培养基筛选及植物激素诱导分化,获得除草剂抗性胡萝卜幼苗,结果为转化后8周,自胡萝卜细胞中分化出除草剂抗性胡萝卜幼苗,提取新分化幼苗总DNA,特异性引物PCR扩增后可见860bp扩增带;Southern-Blot证明有HBsAg基因整合,胡萝卜蛋白萃取物的Western-Blot及ELISA检测证实有HBsAg蛋白表达。利用基因枪转化使质粒pBPC91adr中HBsAg基因在胡萝卜幼苗内整合并表达,提示以植物生产疫苗具有可行性。     

花生体胚诱导再生体系及基因枪转化条件的初步探讨

以花生上胚轴为外植体,研究不同Picloram(毒莠定)浓度处理和不同基因型对体细胞胚胎发生及植株再生的影响,并利用基因枪将含GUS基因的pCAMBIA2301质粒载体轰击体胚,对基因枪转化条件进行了初步探索.结果表明:外植体在添加5 mg/ L Picloram+1 mg/L Glutamine(谷氨酰胺)的MB培养基上诱导的体胚发生率、产胚数及植株再生率最高.不同基因型以‘中花8号'体胚再生率最高(体胚诱导率为55.36%,植株再生率为56.79%).在氦气压力为1 100 psi,轰击距离为9 cm时,体细胞胚GUS瞬时表达率可达到22.95%.     

小麦生长点转化法初报

小麦遗传转化的研究很受重视,但进展一直未尽人意。向小麦受体细胞中导入外源基因已不成问题,但若要得到完整的转化植株则很困难。Vasil等[1]报道的基因枪法转化小麦愈伤组织、并得到完整的转基因植株的工作,是用小麦特殊基因型离体培养系统进行,很难用于其它的基因型。据我们试验,小麦胚芽生长点在经受基因枪轰击后仍能在原位(insitu)状态下发育成完整的植株。因此,直接用小麦的生长点作为外源基因的受体,不仅可以免除转基因过程中的植株再生环节,而且不受基因型的限制。本文报道小麦生长点基因转化研究的初步结果1　材料和方法1.1　材料…     

基因枪轰击谷子幼穗获得转基因植株

以ＪＱ－７００型国产基因枪轰击豫谷２号谷子幼穗,在１５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素选择培养基上筛选到９０８块抗性愈伤组织,其中,绿芽块愈伤５块,共分化出１６株绿苗,组织化学检测ＧＵＳ表达,获得３株阳性植株,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明１株为阳性。以轰击总外植体计算的转基因植株频率为０．０５％。     

小麦抗白粉病相关基因的转化

利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因, 通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析, 优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是2个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的2个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中, 使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株, 进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株, 转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明, 外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性, 表现为延缓了白粉菌的发育。利用玉米花青素苷合成调节基因C1-Lc作为报告基因,通过瞬间表达后愈伤组织表面红色斑点的统计分析,优化了小麦幼胚愈伤组织的基因枪转化参数。小麦Beclin1类似基因TaTBL和硫代硫酸硫转移酶基因TaTST是两个在白粉菌诱导条件下具有增强表达特性的抗病相关基因。本实验进一步利用基因枪将ubi强启动子控制下的两个基因导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织细胞中,使用除草剂经两轮选择培养基上的筛选和再生获得抗性植株,进一步通过抗性植株的PCR分析获得转TaTBL基因植株5株,转TaTST基因植株6株。转基因植株离体叶片的人工接种实验表明,外源基因的导入不同程度上增强了植株的白粉病抗性,表现为延缓了白粉菌的发育。