微藻高效基因枪转化方法的建立

基因枪法是外源基因导入微藻细胞的重要手段。然而,发展至今,微藻细胞基因枪转化效率一直偏低（10~50个转化子/μg DNA）,高价低效的转化方法阻碍了基于高通量转化子的基因功能分析。为了提高基因枪的转化效率,本研究以三角褐指藻为材料,从抗生素选择培养基的改良,微载体的选择、制备、包埋、点膜和轰击参数的优化,以及受体细胞的处理等方面进行了系统研究。结果显示,采用50%海水盐度f/2培养基可以提高博来霉素的效价,f/2固体培养基中2216E营养物质的加入能缩短1/3的平板筛选时间。微载体制备应选择对金（钨）粉没有吸附作用的离心管,制备量/管应少于3.5 mg。微载体轰击量每次大约为0.75 mg,过量将会造成一个轰击死亡圈,过少将导致轰击成本上升。当轰击间距A为6.35 mm,间距B为11 mm,间距C为6 cm时,可以获得最多的转化细胞。109个受体细胞铺成较厚的多细胞层能显著提高转化效率。经过上述优化与改进,本研究将现有文献报道的转化效率提高了4.7~30倍,达到295 ± 60个转化子/μg DNA。该方法除适用于三角褐指藻外,也可广泛应用于其他微藻（杜氏盐藻、小球藻）的基因枪转化研究,可以为微藻基因工程研究提供快速,高效和可靠的操作技术。     

三角褐指藻光合与生长参数测量方法的研究

三角褐指藻是生产生物柴油的优势藻种,监测其光合和生长参数是利用它们生产生物柴油的关键环节。本研究通过细胞计数对细胞生长量进行监测,利用多激发波长调制叶绿素荧光仪(Multicolor PAM)、NanoDrop紫外分光光度计与荧光分光光度计分别检测叶绿素荧光参数、培养基中硝酸盐含量、细胞叶绿素荧光强度与中性脂相对含量。结果显示细胞密度与叶绿素荧光强度只有在生长期才具有线性关系,达到稳定期后,叶绿素荧光强度显著性下降,此时与细胞密度不成比例;PSII最大光化学量子效率F_v/F_m与叶绿素荧光值比生长速率呈正相关,在整个培养阶段F_v/F_m的变化趋势呈现两次上升与下降的过程;光化学淬灭系数qL在培养过程中呈上升趋势,而相对电子传递速率rETR与实际光合效率Y(II)均呈现先升后降的趋势;培养基中硝酸盐含量消耗到一定程度后保持恒定,不再降低;细胞中性脂相对含量在藻细胞接种1天后稍下降,随后持续上升,并在培养基硝酸盐含量不再下降后继续增加。本研究中光合与生长参数测量得到的相关数据,以及培养基硝酸盐含量和细胞中性脂相对含量测量方法的建立,可以为三角褐指藻实验室培养及其代谢产物积累的研究提供必要的研究基础与检测手段。     

鹰嘴豆芽素A对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌外排系统的抑制作用

【目的】MRSA外排系统是其对多种药物耐药性的主要原因,为此研究鹰嘴豆芽素A对MRSA外排系统的抑制作用。【方法】以MRSA41577为供试菌株,通过二倍稀释法、双平板法和荧光分光光度法测定鹰嘴豆芽素A对MRSA41577的抑制作用及其对外排系统的影响;通过RT-PCR检测加药前后MRSA41577外排蛋白norA的表达量;SDS-PAGE检测加药前后与MRSA41577外排相关蛋白的变化,并用液相色谱质谱仪进行鉴定确认。【结果】鹰嘴豆芽素A本身无抑菌活性,但鹰嘴豆芽素A和环丙沙星联合作用后,MRSA41577对环丙沙星的敏感性显著提高,其中40μg/mL的鹰嘴豆芽素A能使环丙沙星对MRSA41577的MIC从64μg/mL降低到8μg/mL,且作用强度与药物浓度呈正相关。经鹰嘴豆芽素A处理MRSA41577后,菌体内环丙沙星的蓄积量随着药物处理时间的增加而增加,在处理15min时与对照组相比,菌体内环丙沙星蓄积量增加了83%(P﹤0.01),与阳性对照利血平的作用效果相当。鹰嘴豆芽素A能降低MRSA41577的norA表达量,与对照组相比,鹰嘴豆芽素A和环丙沙星作用MRSA41577 16h后,norA的相对表达量降低了65%,其抑制效果优于阳性对照利血平的48%。SDS-PAGE电泳结果显示,鹰嘴豆芽素A作用MRSA4157716h后,与对照组相比菌体的蛋白谱带发生了明显的变化,其中与外排系统相关的蛋白除norA蛋白明显减少外,ABC转运体ATP结合蛋白也明显减少。【结论】鹰嘴豆芽素A是MRSA41577的外排泵抑制剂,其作用机制是通过降低MRSA41577菌体内norA基因的表达量,进而减少norA蛋白的表达量,来抑制MRSA41577对环丙沙星等药物的排出而恢复其对药物的敏感性。