解淀粉芽胞杆菌启动基因的克隆及其对地衣杆菌α-淀粉酶基因的调控

用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。     

表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗,首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pV175转移质粒,并将HIV—I中国主要流行株B’／C重组株CN54 gagpol基因置于pV175的启动子pE／L下,构建重组质粒pVl75—Gagpol。重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞。前三轮通过G418加压,噬斑纯化,得到既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒;后三轮在无G418选择压力下,筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的白色重组痘苗病毒。结果表明筛选到了一株重组病毒,经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因已丢失;PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中;抗体染色和Westem blot结果证实该重组病毒能很好地表达目的蛋白。     

集胞藻PCC6803中基因slr1761突变体的构建

PCR扩增了集胞藻PCC6803的slr1761基因,进一步以PGEM-T为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了P1761质粒。通过DNA体外重组,以卡那霉素抗性基因插入目的基因片段,构建了既含目的基因上游及下游序列、又携带选择性标记卡那霉素抗性的PK1761质粒。该质粒转化野生型集胞藻PCC6803细胞,利用同源重组原理获得了能在含卡那霉素的培养基上正常生长的基因敲除突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验证了其基因结构的正确性。     

阿拉伯启动子控制的霍乱毒素B亚单位基因在大肠杆菌中的表达

霍乱毒素B亚单位是预防霍乱重要的保护性抗原,由霍乱毒素B亚单位组成的新的口服疫苗已经大量人体试验证明安全有效,此外霍乱毒素B亚单位是很强的粘膜免疫原,当与无关抗原结合在一起口服时,也是一个很好的佐剂。为获得大量霍乱毒素B亚单位,采用DNA重组技术,将霍乱毒素B亚单位基因与阿拉伯糖操纵子的表达载体pMPM-A4Ω质粒进行重组,pMPM-A4Ω表达载体是由阿拉伯糖(L-ara)所调控,具有高拷贝表达的特点。我们成功地构建了重组质粒和工程菌菌株,对其     

大肠杆菌启动基因的重组和表达 Ⅰ.不同启动基因对β-半乳糖苷酶结构基因表达的影响

质粒pKL6带有β-半乳糖苷酶结构基因(lacZ),启动基因突变失活,lacZ不能表达。在lacZ前插入外源DNA片段,观察lacZ的表达,可以研究启动基因的功能作用。我们用大肠杆菌染色体DNA的HindⅢ片段与pKL6重组,获得一批重组体,对这些重组体的β-半乳糖苷酶的活力水平和限制性图谱作了分析,对它们用作表达载体的可能性进行了讨论。     

表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗,首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pVI75转移质粒,并将HIV-I中国主要流行株B'/C重组株CN54 gagpol基因置于pVI75的启动子pE/L下,构建重组质粒pVI75-Gagpol.重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞.前三轮通过G418加压,噬斑纯化,得到既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒;后三轮在无G418选择压力下,筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的白色重组痘苗病毒.结果表明筛选到了一株重组病毒,经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因已丢失;PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中;抗体染色和Western blot结果证实该重组病毒能很好地表达目的蛋白.     

霍乱毒素B亚单位基因分泌型表达载体的构建及转化烟草的研究

为了探索利用植物分泌特性来表达重组蛋白的可行性,先构建了含钙网蛋白信号肽的植物双元载体pBIcal,再向该载体中插入霍乱毒素B亚单位编码基因,最后得到表达载体pBIcal—ctb。通过根癌农杆菌介导,该表达载体转化烟草,在卡那霉素抗性培养基上筛选,得到30棵抗性植株。经PCR鉴定,霍乱毒素B亚单位基因已经整合到烟草基因组中。初步表达分析表明,转基因烟草中含有具生物活性的霍乱毒素B亚单位蛋白。     

带有K88与K99两种伞毛抗原基因的重组质粒的构建

产肠毒素大肠杆菌能引起仔猪、犊牛、羔羊等新生幼畜发生急性腹泻,K88与K99是这类产肠毒素大肠杆菌所产生的两种在免疫性质上不同的伞毛抗原。质粒pTK8899—6和pTK8899—8是由来自K99质粒DNA的4．5×10⁶道尔顿大小的BamHI片段与带有K88伞毛抗原基因的质粒pTK90DNA重组而构建成的;带有pTK889g一6或pTK8899—8的大肠杆菌c600菌株均能同时产生K88与K99两种伞毛抗原。限制性酶切图谱的研究表明,pTK88g9—6与pTK8899—8 DNA的分子量均为11．85×10⁶道尔顿,但这两种重组DNA中所带Kg9伞毛抗原基因的片段连接在载体DNA上的方向彼此相反,带有pTK8899—6或pTK8899—8的大肠杆菌c600菌株在产生K88或K99伞毛抗原的能力上没有明显的差别。带有K88与K99两种伞毛抗原基因重组质粒的大肠杆菌菌株有可能用作预防仔猪,犊牛和羔羊急性腹泻的菌苗。     

Ketogulonigenium vulgare四环素诱导表达穿梭质粒的构建

采用重叠延伸PCR方法合成阻遏蛋白的编码基因tetr和插入操纵基因teto的Ketogulonigenium vulgare山梨糖脱氢酶启动子psndhteto的基因序列,借助宽宿主质粒p BBR1MCS-5,构建四环素诱导表达的穿梭质粒,转化Ketogulonigenium vulgare,获得阳性重组菌株,实现卡那霉素抗性的调控表达,结果表明:培养重组菌株2小时后,添加0.4μg/ml的四环素诱导剂后,能够在含有卡那霉素的培养基中生长,不添加四环素诱导剂的重组菌株不能在含卡那霉素的培养基中生长,确定了最适四环素的诱导浓度为0.6μg/ml。     

粘球菌基因功能和表达情况分析质粒pZCY11的构建及其应用

【目的】旨在构建一个用于粘球菌基因插入失活、同时可通过报告基因分析插入位点基因表达情况的质粒载体,并应用该质粒对黄色粘球菌MXAN1334基因功能和表达情况进行分析。【方法】通过PCR、酶切和连接等方法构建质粒载体pZCY11。从黄色粘球菌DK1622基因组上PCR扩增MXAN1334基因内部部分片段,插入载体pZCY11上lacZ基因的上游,构建重组质粒pZCY13,将其转入DK1622菌株,获得MXAN1334基因插入失活突变株ZC16-18。【结果】基因功能和表达情况分析质粒载体pZCY11含有抗性标记基因aph、自杀性质粒复制子OriR6K和无启动子的报告基因lacZ。突变株ZC16-18在CTT软硬琼脂平板上菌落扩展结果显示,MXAN1334基因插入失活会造成黄色粘球菌S运动能力缺陷。通过X-gal检测突变株ZC16-18中β-半乳糖苷酶酶活,实验结果显示,含有X-gal的平板上培养的ZC16-18菌落呈现蓝色,表明MXAN1334基因能够表达;颜色呈现的时间分析结果显示,MXAN1334基因表达时间较早。【结论】构建的质粒载体pZCY11不仅能够对目的基因进行功能的分析,而且能够同时通过报告基因分析基因的表达情况,可简化粘球菌中基因功能及表达情况的研究。     

利用λ-Red重组系统和平衡致死系统改造抗药性致腹泻工程疫苗

质粒pMM085是含有猪毒素源性大肠杆菌(ETEC)的黏附素K88与无毒肠毒素LTA-B 基因的重组质粒,含氯霉素抗性基因,由此构建的菌苗株带有抗药性。利用平衡致死系统改建此疫苗株,即将质粒上的氯霉素抗性基因cat替换成asd基因,并把新构建的质粒转移到缺失asd基因的大肠杆菌X6097中。但由于质粒pMM085是一个23kD的大质粒,传统的基因工程操作不易进行,利用λ-Red重组系统,将表达Red重组蛋白的质粒pKD46转化含pMM085的大肠杆菌X6097,并用两端各带有39ntcat基因同源区、含全长asd基因的PCR产物电击转化此感受态细胞,在λ-Red重组系统的帮助下,成功实现了asd基因对cat基因的置换。     

克隆毒素源性大肠杆菌K88ac抗原基因

E.coli79-l454(08：K88ac K31：H^-)是北京生物制品检定所从上海郊区腹泻的仔猪分离到的野生型毒素源性大肠杆菌,该菌产生K88ac抗原,产生热敏感毒素(LT)和热稳定毒素(sT)。发酵棉子糖,抗四环素,含有50Md的大质粒。用碱变性法提取,以线性cscl-EB密度梯度离心法纯化大质粒,用HindⅢ酶消化,回收6.5Md的片段,与载体pBR322连接,转化到E.coliRRl,选出Ap¹Tc²的转化子,用玻片凝集,琼艚扩散。K88ac抗血清致敏的绵羊红细胞反向间接血凝,被动溶血,ELISA等方法检测K88ac抗原均为阳性的重组体,其中一株命名为E.coliRR1(pMM031),酶切图谱表明除含pBR322 DNA的片段外,还台有约为6．5Md的片段,此片段是HindⅢ酶消化大质粒DNA产生的第二条片段,含有为K88ac抗原基因编码的遗传决定子。用LT基因探针菌落原位杂交,Y—l肾细胞试验等方法检测结果表明重组体不产生LT;用乳鼠试验及STb基因探针杂交均是阴性,说明重组体不产生ST。由此可见重组体产生K88ac抗原,但无毒性,有可能用作疫苗栋,也可以与其他因子配伍构建成更好的活疫苗株。     

表达大肠杆菌K88ac-ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用PCR技术,从大肠杆菌C83902质粒中扩增出K88ac基因、ST1突变基因和LTB基因,通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化,构建了含K88ac-ST1-LTB融合基因表达载体的重组菌株BL21（DE3）（pXKST3LT5)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pXKST3LT5中含有K88ac-ST1-LTB融合基因,且基因序列和阅读框架均正确。经ELISA检测,重组菌株表达的K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、LTB和K88ac抗体识别。经乳鼠灌胃试验证实,表达的融合蛋白已丧失天然ST1肠毒素的活性。免疫实验结果表明,K88ac-ST1-LTB融合蛋白能够诱发小白鼠产生抗体,该抗体具有中和天然ST1肠毒素的毒性作用,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪黄、白痢基因工程菌苗的候选菌株。     

肠产毒性大肠埃希菌F4ac菌毛蛋白FaeG亚单位的原核表达及免疫学鉴定

目的克隆并表达肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG,为制备预防幼畜ETEC感染的疫苗奠定基础。方法以ETEC（C83902）基因组DNA为模板,PCR扩增faeG基因,插入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建重组质粒pGEX-faeG。将pGEX-faeG转化大肠埃希菌BL-21I,PTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达蛋白的相对分子质量和表达形式,Western blot鉴定其抗原性。将表达菌超声破碎后离心提取包涵体制备抗原,经口灌喂免疫小鼠,检测小鼠血清中抗FaeG的IgGI、gA,鉴定其免疫原性。结果扩增的faeG基因全长786 bp,与基因文库中的faeG基因同源性达96%。重组质粒pGEX-faeG经PCR及双酶切鉴定确有插入片段,且序列完整。表达产物FaeG相对分子质量约53 kD,主要存在于碎菌后的沉淀中,以包涵体形式表达。Western blot显示该蛋白可与ETEC F4ac阳性血清特异性结合,免疫后小鼠血清抗FaeG IgGI、gA明显高于PBS和GST对照组。结论成功构建了ETEC F4ac菌毛蛋白亚单位FaeG的重组质粒pGEX-faeC,表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原表达了重组蛋白FaeG,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于研制预防幼畜ETEC感染的疫苗。     

pBR322-Red介导的E.coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coli W3110染色体lacZ,lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株:CWL2、CWL4和CWL6.荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达.为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1.证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中.结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达.     

pBR322-Red介导的E．Coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,Kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coli W3110染色体lacZ, lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株：CWL2、CWL4和CWL6。荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达。为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1。证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中。结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达。     

融合基因gfp-lacZ在克隆载体pGEM3Z-f(+)中高效表达

目的:将gfp基因克隆到pGEM3Z-f( )载体。方法:将PCR扩增得到的gfp基因插入到pGEM3Z-f( )质粒的SmaⅠ位点,构建重组质粒转化大肠杆菌DH5α。结果:含重组质粒的大肠杆菌在自然光下呈现黄绿色,而在涂X-gal的培养基上它不仅发出黄绿色荧光,而且还出现蓝色。结论:gfp基因的插入没有引起载体上lacZ基因的失活,而且形成的gfp-lacZ融合基因在大肠杆菌得到了表达。表达产物不仅具有GFP活性,而且保持了β-半乳糖苷酶的生物学活性。     

促DNA修复多效蛋白诱导因子pprI逆转录病毒载体系统的构建及其鉴定

目的:为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的稳定遗传与表达,构建重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI。方法:将目的基因pprI亚克隆经过双酶切后定向连接到pLXIN质粒上,构建逆转录病毒重组质粒pLXIN-pprI。将pLXIN-pprI转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,氨苄青霉素筛选后抽提获得重组质粒pLXIN-pprI,双酶切及DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及测序结果显示结果与预期相符,pprI基因成功插入pLXIN逆转录病毒载体中。结论:重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI构建成功,为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的重组与表达奠定了基础。     

用遗传工程技术构建含E．Coil K88ac和 LT(A-B+)两种抗原基因的菌株

用我室克隆的含大肠杆菌K88ac抗原基因的pMM031质粒和含肠毒素LT(A^-B⁺)抗原基因的质粒pPMc4,使用限制性内切酶BamHI酶解,取得了K88ac抗原基因的片段,再经和BamH I消化的质粒pPmc4连接重组,构建了同时具有这两种抗原基因的质粒pMM085羟琼脂糖凝胶电泳分析,pMM085质粒的分子量约为14．6Md,在宿主菌E．CoilC600,经过ELISA和反向间接血凝等几种试验测定K88ac抗原,结果都说明其抗原产量与亲本菌株基本相同。重组菌的抗甘露糖豚鼠红细胞凝集反应也是阳性。对肠毒素抗原用被动溶血试验测定,结果说明其LT-B的产量和亲本菌的产量也基本相同。重组的工程菌株经兔肠结扎试验表明没有毒性反应,因此重组菌株可以作为预防仔猪腹泻的活菌疫苗候选株。     

可调控表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系的建立与鉴定

甲型流感病毒M2蛋白是一种具有离子通道功能的跨膜蛋白,其氨基酸序列非常保守,可用于流感通用疫苗的研究。为了构建可调控的稳定表达甲型流感病毒M2蛋白的哺乳动物细胞系,首先应用PCR方法从含有流感病毒PR8株第七节段全长基因的质粒中扩增得到M2基因。将该片段亚克隆到真核表达载体pcDNA5/FRT/TO上,用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确后将重组质粒与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In T-REx-293细胞,使目的基因整合到宿主细胞染色体。筛选具有Hygromycin B抗性的细胞株。在该细胞的培养基中加入四环素以诱导目的基因表达,48 h后通过间接免疫荧光方法检测到M2蛋白的表达。共得到16株高表达M2蛋白的重组细胞株,这些细胞株在传10代后仍能稳定表达目的蛋白。未加四环素诱导的细胞没有检测到M2蛋白,说明四环素调控系统严格控制着目的基因的表达。今后,该细胞系可用于流感病毒M2蛋白的功能研究、流感候选疫苗的免疫学评价以及流感病毒减毒活疫苗的研制。