表达HIV-I CN54株gagpol基因重组痘苗病毒疫苗株的构建

为研制不带筛选标记的HIV活载体疫苗，首先构建含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的pV175转移质粒，并将HIV—I中国主要流行株B’／C重组株CN54 gagpol基因置于pV175的启动子pE／L下，构建重组质粒pVl75—Gagpol。重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染鸡胚细胞。前三轮通过G418加压，噬斑纯化，得到既含目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒；后三轮在无G418选择压力下，筛选只含目的基因而缺失了筛选标记的白色重组痘苗病毒。结果表明筛选到了一株重组病毒，经PCR和Dot blot检测确认该株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因已丢失；PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒中；抗体染色和Westem blot结果证实该重组病毒能很好地表达目的蛋白。