稳定表达流感病毒基质蛋白2的哺乳动物细胞系的建立

本研究构建了稳定表达甲型流感病毒基质蛋白2(M2)的哺乳动物细胞系。应用PCR方法扩增A/PR/8/34(H1N1)株流感病毒M2基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)上,构建出pDF-M2重组质粒。将鉴定正确的pDF-M2与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的基因整合到宿主细胞染色体上。筛选具有Hygromycin B抗性的重组细胞株命名为CHO-M2。以间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测M2的表达,共获得15株高表达M2蛋白的重组细胞株。这些重组细胞株在连续培养10代后,PCR方法仍可检测到M2基因的存在,IFA也检测到蛋白的稳定表达。本研究成功获得了稳定表达甲型流感病毒M2的哺乳动物细胞系,为M2蛋白的功能研究和非复制型流感病毒疫苗的研制提供了新的工具。     

甲型流感病毒M1基因真核表达载体的构建及其表达

研究旨在构建含有甲型流感病毒M1基因的真核表达载体,并探讨其在真核细胞中的表达.提取流感病毒Influenza A/FM/1/47 (H1N1) RNA,RT-PCR扩增M1基因并将目的基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到Vero细胞,免疫荧光技术鉴定其表达.甲型流感病毒M1蛋白重组质粒pcDNA3.1-M1的成功构建,为开发研制流感病毒保守蛋白DNA疫苗奠定了基础.     

甲3型流感病毒M2基因在痘苗病毒天坛株中的表达

为获得表达甲3型流感病毒(H3N2)M2蛋白的重组天坛株痘苗病毒RVJ1175M2,使用PCR方法扩增流感病毒全长M2基因,将其克隆到天坛株痘苗病毒同源重组质粒pJSC1175中,获得重组质粒pJSC1175M2,通过与痘苗病毒载体同源重组,构建了含流感病毒M2基因的重组痘苗病毒株RVJ1175M2。PCR检测结果证明,流感病毒(H3N2)M2蛋白基因准确插入到天坛株痘苗病毒TK区;Western blot、免疫荧光和流式细胞计数表明重组病毒RVJ1175M2可以有效地表达M2蛋白,表达的M2蛋白有两条带,分别为15kD和13kD,与相关文献报道一致;M2蛋白可有效分布在感染细胞的细胞膜上。这些结果表明重组痘苗病毒株RVJ1175M2可以有效地表达流感病毒M2蛋白,为使用表达M2蛋白的不同类型疫苗进行广谱流感疫苗效果的比较研究奠定了基础。     

由乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP)递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究

目的:构建以HBc为载体的甲型流感病毒HA和M2e流感通用疫苗(Flu@uV),利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,进行初步的蛋白表达及纯化。在此基础上,构建DNA流感通用疫苗。方法:利用全基因合成的序列为模板,成功构建HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc基因的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE、Western blot和电镜检测其表达。将纯化的蛋白与弗氏佐剂共同免疫小鼠,取小鼠外周血进行流式细胞分析。通过荧光分析和Western blot初步验证DNA流感通用疫苗在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达情况。结果:成功表达纯化了HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc四种蛋白,经电镜观察到30nm左右的蛋白纳米颗粒样结构。小鼠外周血流式细胞分析显示HBc和3M2e-HBc可以增加小鼠的免疫力,而HA-M2e-HBc和M2e-HBc对小鼠免疫力的提高没有影响。通过荧光检测和Western blot检测说明DNA流感通用疫苗在真核细胞中成功表达。结论:成功构建HBc与甲型流感病毒HA和M2e的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了重要基础。     

稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白细胞的构建

获得稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白的HEK-293-HA细胞株。采用RT-PCR方法扩增乙型流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建pcDNA3.1(+)-HA重组质粒。将已鉴定正确的pcDNA3.1(+)-HA质粒与辅助质粒PLV-EF1a-EGFP(2A)Puro通过脂质体介导法共转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选后得到重组细胞株HEK293-HA,通过流式细胞术法(FCM)来检测细胞中HA的表达情况。所得到的重组细胞经扩大培养后再连续培养15代,采用间接免疫荧光法(IFA)和蛋白免疫印迹法(WB)来检测HA蛋白表达的稳定性。结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)-HA经双酶切及测序鉴定正确;共获得3株高表达阳性细胞株。细胞扩大培养后连续传代培养15代后进行Western blot和IFA检测结果表明,重组细胞的HA蛋白得到稳定的表达。已成功获得了能稳定表达乙型流感病毒血凝素蛋白的HEK-293-HA细胞,可为乙型流感病毒HA蛋白的进一步研究提供良好的基础。     

利用靶定基质蛋白基因m的小干扰RNA抑制2009甲型H1N1流感病毒的复制

目的:设计、构建并筛选针对流感病毒基质蛋白基因m的小干扰RNA(siRNA),检测其对2009甲型H1N1流感病毒复制的抑制效果。方法:设计3条针对流感病毒m基因的siRNA,并克隆到短发夹型(shRNA)siRNA表达载体pSilencer2.1-U6-hygro上;经测序证明构建成功后,将表达3种siRNA的质粒和阴性对照质粒psiRNA-control分别转染MDCK细胞,用潮霉素筛选稳定表达细胞株,用H1N1流感病毒感染细胞,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果。结果:构建了3个针对流感病毒m基因的siRNA表达质粒,3种siRNA均使m基因的mRNA水平降低,其中M1-306的抑制效率达60%;3种siRNA均使流感病毒NA蛋白的表达量降低,M2-25、M1-105的抑制效率明显,M1-306略低。结论:针对m基因的siRNA可以有效抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。     

稳定表达乙脑病毒结构蛋白的细胞系的建立

以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组克隆质粒pBR-JTF为模板,通过PCR分别扩增prM-E及C-prM-E基因片段,构建表达乙型脑炎病毒结构蛋白的真核表达质粒pCJE-ME及pCJE-CME。将这2种重组质粒用脂质体法转染BHK-21细胞后,质粒pCJE-ME表现明显的细胞毒性,转染细胞不能存活;质粒pCJE-cME可导致筛选到表达JEV结构蛋白的稳定细胞系,这种稳定表达JEV结构蛋白的细胞系通过PCR扩增细胞系基因组、ELISA、Western Blot、间接免疫荧光等方法得到鉴定。研究结果表明在C蛋白存在下,乙型脑炎病毒C-prM-E蛋白可以在BHK细胞中稳定表达,为研制JEV新型复制子颗粒疫苗提供了便利工具。     

A型流感病毒H5N1的M2离子通道稳定细胞株的建立

A型流感病毒H5N1的M2离子通道(H5M2)基因经优化后由人工合成,适合于哺乳动物细胞中表达.通过酶切克隆于pcDNA4质粒,并在HEK293细胞中建立稳定细胞株.Western blotting和免疫荧光证实H5M2在稳定细胞中只有在四环素诱导下才能表达,并经膜片钳证实在HEK293细胞中表达的H5M2具有H 通道活性,为M2离子通道功能的研究和M2离子通道阻断剂筛选方法的建立提供了参考.     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体。首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培 养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV- VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX △E3VP2。用Sal I Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2 全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2。Cla I Asc I酶切pCAV-2-FPV- VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2。该重组病毒能使MDCK细胞产生 腺病毒样细胞病变。Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白。该重组病毒可以有 效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体。本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株。     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体.首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV-VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX△E3VP2.用Sal I+Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2.Cla I+Asc I酶切pCAV-2-FPV-VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2.该重组病毒能使MDCK细胞产生腺病毒样细胞病变.Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白.该重组病毒可以有效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体.本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株.     

流感病毒神经氨酸酶的表达及其在药物筛选中的应用

A型流感病毒H5N1神经氨酸酶奥司他韦敏感型及耐药突变型基因经优化后,克隆于pcDNA4/TO 表达载体,并转染T-REx293 建立稳定细胞株,经四环素诱导能特异表达神经氨酸酶,其活性被特异性抑制剂奥司他韦所抑制。利用该稳定细胞株制备的神经氨酸酶,对3000多种天然产物和中药提取物进行了筛选,结果显示黄芩甙和黄芩素对奥司他韦敏感型神经氨酸酶和耐药型神经氨酸酶具有相似的抑制作用。该神经氨酸酶制备方法安全、简便、稳定,有利于建立神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选方法。A型流感病毒H5N1神经氨酸酶奥司他韦敏感型及耐药突变型基因经优化后,克隆于pcDNA4/TO 表达载体,并转染T-REx293 建立稳定细胞株,经四环素诱导能特异表达神经氨酸酶,其活性被特异性抑制剂奥司他韦所抑制。利用该稳定细胞株制备的神经氨酸酶,对3000多种天然产物和中药提取物进行了筛选,结果显示黄芩甙和黄芩素对奥司他韦敏感型神经氨酸酶和耐药型神经氨酸酶具有相似的抑制作用。该神经氨酸酶制备方法安全、简便、稳定,有利于建立神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选方法。     

四环素诱导可控表达细胞周期素B1单克隆的筛选

目的筛选四环素诱导细胞周期素B1（CyclinB1）可控表达的293单克隆细胞株（tetracycline-regulated expression 293 cells,T-REx^TM-293）。方法从人胎肝cDNA文库中PCR带有酶切位点的CyclinB1基因全长,将其酶切后插入到pcDNA4／TO／myc-HisB载体中。然后用测序正确的质粒转染T-RExTM-293细胞,加杀稻瘟菌素（Blasticidin）和腐草霉素（Zeocirt）双药物筛选两周后,传96孔板,等单个细胞扩增出单克隆。然后用Western印迹和流式细胞仪检测CyclinB1的诱导表达情况。结果构建好的pcDNA4／TO／myc-HisB—CyclinB1载体,经鉴定序列正确。筛选出的单克隆细胞株,在未加四环素时没有外源性的CyclinB1表达,在加入四环素后,3h就有表达,随时间的增加,CyclinB1表达量也增加,48h最多。结论筛选出的T-REx^TM-293单克隆细胞株能可控表达CyclinB1。     

Fast set-up of doxycycline-inducible protein expression in human cell lines with a single plasmid based on Epstein-Barr virus replication and the simple tetracycline repressor

We have developed a novel plasmid vector, pEBTetD, for full establishment of doxycycline-inducible protein expression by just a single transfection. pEBTetD contains an Epstein-Barr virus origin of replication for stable and efficient episomal propagation in human cell lines, a cassette for continuous expression of the simple tetracycline repressor, and a cytomegalovirus-type 2 tetracycline operator (tetO2)-tetO2 promoter. As there is no integration of vector into the genome, clonal isolation of transfected cells is not necessary. Cells are thus ready for use 1 week after transfection; this contrasts with 3-12 weeks for other systems. Adequate regulation of protein expression was accomplished by abrogation of mRNA polyadenylation. In northern analysis of seven cDNAs coding for transport proteins, pools of transfected human embryonic kidney 293 cells showed on/off mRNA ratios in the order of 100:1. Cell pools were also analyzed for regulation of protein function. With two transport proteins of the plasma membrane, the on/off activity ratios were 24:1 and 34:1, respectively. With enhanced green fluorescent protein, a 23:1 ratio was observed based on fluorescence intensity data from flow cytometry. The unique advantage of our system rests on the unmodified tetracycline repressor, which is less likely, by relocation upon binding of doxycycline, to cause cellular disturbances than chimera of tetracycline repressor and eukaryotic transactivation domains. Thus, in a comprehensive comparison of on- and off-states, a steady cellular background is provided. Finally, in contrast to a system based on Flp recombinase, the set-up of our system is inherently reliable.     

甲型H5N1流感病毒M2与HA双基因载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价

高致病性H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) 严重威胁到人类健康,因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作为研究对象,PCR扩增基质蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全长开放阅读框片段,构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因 M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外,还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光 (IFA) 方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制 (HI) 实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。     

Consecutive gene deletions in Mycobacterium smegmatis using the yeast FLP recombinase

Mycobacteria contain a large number of redundant genes whose functions are difficult to analyze in mutants, because there are only two efficient resistance markers available for allelic exchange experiments. We have established a system based on the Flp recombinase of the yeast Saccharomyces cerevisiae for use in the nonpathogenic model organism Mycobacterium smegmatis. This system consists of a hygromycin resistance cassette flanked by two Flp recognition targets (FRT) in direct orientation and a curable plasmid for expression of the flp gene. The FRT-hyg-FRT cassette was used on a suicide plasmid and on a conditionally replicating plasmid to delete two of the four known porin genes of M. smegmatis, mspA and mspC, respectively, by homologous recombination. The hyg gene was specifically removed from the chromosome of both mutants upon expression of the flp gene. Based on the marker-less mspC mutant strain, a double knock-out mutant lacking also mspA was obtained using the same strategy. Thus, by a fast and efficient two-step procedure, each of the porin genes was replaced by a single FRT site, which can be further used for site-specific integration. These results show that the Flp/FRT system is a suitable genetic tool for constructing unmarked mutations and for the analysis of redundant genes by consecutive gene deletions in M. smegmatis.     

鸭白介素-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从克隆质柱pGEM-DuIL-18扩增出鸭IL-18全基因片段,克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建重组质粒pcDNA3.1/DuIL-18(简称pDuIL-18).将重组质粒pDuIL-18转染Cos7细胞,转染细胞中含鸭IL-18基因的mRNA.SDS-PAGE分析表明,表达产物是与鸭IL-18相符的约23 000的蛋白条带.鸭淋巴细胞转化试验表明,表达产物对鸭淋巴细胞具有明显诱导转化作用.重组质柱pDuIL-18对H<,9>亚型禽流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明重组质粒pDuIL-18能够提高禽流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答,为研究能够更好地防制禽流感的新型疫苗提供了新的思路.     

人Polo样激酶1基因的克隆表达及其影响c-Abl表达水平功能的初探

目的:克隆并在293细胞中表达人Polo样激酶1(Plk1)基因,探索Plk1对非受体型酪氨酸激酶c-Abl表达水平的影响。方法:利用PCR法扩增Plk1基因,分别定向克隆至pcDNA3-Flag及pCMV-Myc真核表达载体,将上述质粒分别转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达;将上述质粒分别与c-Abl表达质粒共转293细胞,检测带有不同标签的Flag-Plk1或Myc-Plk1对细胞中c-Abl激酶表达的影响。结果:构建了Flag-Plk1和Myc-Plk1真核表达质粒,其在293细胞中均可表达,蛋白的相对分子质量为68×103;与其共转的c-Abl激酶表达水平显著下调。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1和Myc-Plk1蛋白,且初步发现Plk1可以抑制c-Abl的表达。     

整合HA蛋白的HIV假病毒展示禽流感病毒感染宿主细胞机制

通过将高致病性禽流感病毒HA蛋白整合到HIV颗粒,包装成表达HA蛋白的假病毒粒子（命名为HIV/H5-HA）,并对所包装的假病毒的生物学功能进行了研究.通过RT PCR获得了H5N1亚型禽流感病毒完整的血凝素基因(HA)并克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,通过与假病毒构建体系的2种质粒pCMV△8.2和pHR′-CMVLacZ共转染293T细胞,包装成假病毒颗粒.利用LacZ染色和HA假病毒颗粒感染MDCK等6种细胞株并对标记基因LacZ进行检测.结果表明,HIV/H5-HA与天然的禽流感病毒相似,具有广泛的细胞嗜性; Western 印迹和FACS检测结果,和HA假病毒颗粒的电镜照片确认了HA基因在假病毒颗粒表面得到了表达;HIV/H5-HA能够凝集鸡红细胞,并且pH值依赖性测定表明,HA假病毒需要低pH值才能实现正确的入侵宿主细胞.本研究结果显示：禽流感病毒H5N1亚型的HA基因得到了有效的包装,并且所包装的假病毒颗粒能够表达具有高度生物活性的HA蛋白.同时,假病毒模型的建立为进一步研究禽流感病毒与宿主之间的免疫应答提供了一种新的途径.