不同载体表达的人类细小病毒B19壳蛋白VP2的抗原性比较研究

构建表达质粒pcDNA3 VP2,将其转染CHO细胞建立了稳定表达的细胞系;用间接免疫荧光法和Western印迹证明了表达的VP2蛋白的特异性。对昆虫杆状病毒系统表达的VP2蛋白作初步纯化。分别用由大肠杆菌、CHO细胞和昆虫杆状病毒表达系统表达的VP2蛋白,以间接免疫荧光法和ELISA法检测人群血清中的VP2抗体,结果表明,间接免疫荧光法的敏感性高于ELISA法。     

人sApo2L-Fc的分子构建及其在CHO细胞中的表达

目的：构建人sApo2L-Fc分子,在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达有生物学活性的人Apo2L-Fc融合蛋白。 方法：将sApo2L-Fc基因克隆入pcDNA3.1（+）表达载体,重组质粒转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性克隆扩大培养,提取质粒进行酶切鉴定;采用脂质体法将重组质粒转入CHO细胞,经G418加压筛选、ELISA检测,挑选表达较高的阳性转化子扩大培养;表达的sApo2L-Fc融合蛋白经Protein A亲和柱纯化,纯化产物用SDS-PAGE、Western Blotting检测样品的分子量及免疫原性,用L929细胞进行生物活性测定。 结果：酶切鉴定及测序显示重组子构建与预想一致;ELISA证实了sApo2L-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达;SDS-PAGE检测到纯化产物的分子量与理论分子量相符;在同样的位置,Western Blotting显示阳性;L929细胞测定：纯化产物的生物学活性达1.0×105IU/mg。 结论：构建了sApo2L-Fc的表达载体,并成功地在CHO中表达,表达的sApo2L-Fc融合蛋白具有生物学活性。     

CD14蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

摘要 目的：制备CD14重组蛋白及抗CD14单克隆抗体。方法：从人外周血淋巴细胞中克隆CD14编码基因,将其连接至质粒pRSETC,构建表达质粒pRSETC/CD14,转染大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选阳性克隆、用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测CD14蛋白表达水平,应用镍柱进行亲和纯化,SDS-PAGE及Western blot进行纯化产物鉴定。纯化后的CD14蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选分泌单克隆抗体细胞株,制备单克隆抗体,利用Western blot鉴定抗体活性。结果：获得CD14编码基因,并成功进行了原核表达,SDS-PAGE显示CD14以包涵体形式表达,纯化产物的纯度超过95%。利用杂交瘤技术筛选出稳定分泌抗CD14抗体的细胞株,并制备了高纯度的单克隆抗体,抗体具有CD14蛋白结合活性。结论：成功表达纯化了CD14蛋白,并制备了抗CD14单克隆抗体,为后续开发CD14检测技术提供抗体。     

猪源肠出血性大肠杆菌CD18株fedA基因的克隆及表达

目的:获得重庆猪源肠出血性大肠杆菌(EHEC)强毒株CD18株fedA基因表达产物。方法:根据GenBank中的fedA基因序列设计引物,从重庆猪源EHEC强毒株CD18株基因组中经PCR扩增目的片段,克隆到pUC19质粒,亚克隆到表达载体pET28b( )的SalⅠ-HindⅢ位点后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni柱法纯化,SDS-PAGE及Western印迹检验表达产物。结果:CD18株fedA与文献报道的fedA的序列同源性为99.3%,推导的氨基酸序列的同源性为98.7%,表达产物在50～100mmol/L咪唑洗脱时出峰,SDS-PAGE显示其相对分子质量20000,Western印迹证明该蛋白条带能与分子标记蛋白His6抗体发生特异反应。结论:克隆到猪源EHECCD18株fedA基因,并在大肠杆菌中得到表达。     

幽门螺杆菌HP0762蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体制备

目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体。方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6×His编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的多克隆抗体;用ELISA和Western印迹检测抗血清。结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762。结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础。     

拟南芥SHORT-ROOT基因稀有密码子分析及其在原核细胞中的表达和纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达拟南芥SHORT-ROOT(SHR)蛋白并纯化。方法:将SHR基因编码区克隆至p GEX-4T-2表达载体,构建重组质粒p GEX-4T-2-SHR并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),表达产物经谷胱甘肽亲和层析凝胶4B分离纯化,SDS-PAGE分析和Western印迹鉴定。结果:SHR融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的86×103,且经Western印迹确证。结论:获得了拟南芥SHR融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人接头蛋白NRBP的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:制备接头蛋白NRBP的兔多克隆抗体,并检测该抗体的效价及特异性。方法:PCR方法以重组质粒PEF-NRBP为模板,获得NRBP全长及NRBP(1-99Aa)cDNA,构建到原核表达质粒pET-21a及pGEX-6P-1中。分别转入大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导表达后,纯化并鉴定表达产物将其免疫家兔,间接ELISA法及免疫印迹等方法鉴定抗体。结果:成功获得人NRBP的cDNA,构建得到相关的原核表达质粒,在大肠杆菌中可诱导性高表达,纯化后蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经ELISA检测为阳性结果,4只免疫家兔的抗体效价约为1:5 200～1:40 000。Western印迹结果显示,该抗体可特异性的识别真核细胞外源性及内源性约60kDa的NRBP蛋白,并且具有较强免疫沉淀能力。结论:NRBP多克隆抗体具有很好的特异性和敏感性,该抗体的成功制备为进一步研究NRBP的功能提供了重要工具。     

脊髓损伤修复相关10号蛋白在COS7细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:在COS7细胞中表达脊髓损伤修复相关10号蛋白(SCIRR10),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:在实验室前期研究基础上,用PCR方法扩增SCIRR10基因,将其克隆入pcDNA3.1/myc-HisA穿梭质粒中,转染COS7细胞进行表达;对表达产物用金属螯合层析方法纯化,并进行SDS-PAGE和Western印迹检测。结果及结论:构建了含有SCIRR10基因的穿梭质粒pcDNA3.1/myc-His-SCIRR10,并使其在COS7细胞中得到表达,纯化后的重组蛋白SCIRR10-His-myc的纯度在80%以上,可用于下一步的实验研究。     

利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA基因

幽门螺杆菌cagA基因克隆到杆状病毒表达系统的pBlueBacHis2A转移载体中,将重组质粒pBlueBacHis2A-CagA与亲本病毒Bac-N-blue DNA共转染Sf9细胞,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒.经PCR法鉴定后进行扩增培养,SDS-PAGE和Western bolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白,间接ELISA分析表明,表达产物可与Hp感染者血清发生特异性的免疫反应.     

小鼠黑色素瘤相关抗原MART1的原核表达及抗体制备

目的:利用基因重组技术获得鼠黑色素瘤相关抗原MART1,并制备兔抗鼠多克隆抗体。方法:采用RT-PCR方法从小鼠黑素瘤B16-F1细胞株总RNA中扩增MART1的编码c DNA序列,并构建p ET32a-MART1原核表达质粒,将此质粒转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株后用IPTG诱导表达,获得的MART1融合蛋白依次用Ni-NTA亲和层析和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化,纯化的MART1融合蛋白用SDS-PAGE和Western印迹鉴定;以纯化的MART1融合蛋白为抗原,皮内接种日本大耳白兔,制备多克隆抗体,采用ELISA、Western印迹和细胞免疫荧光法分别检测兔血清中抗体的效价及抗原的特异性。结果:构建出MART1原核表达质粒,小鼠MART1基因在大肠杆菌Rosseta(DE3)中可诱导性表达并有效纯化;用纯化的MART1蛋白在日本大耳白兔中制备出高效价的多克隆抗体(效价1∶1 024 000),该抗体可与原核及真核表达的MART1蛋白特异性结合。结论:建立了鼠MART1蛋白原核表达和纯化技术,制备出的高效价和特异性抗MART1多克隆抗体将为黑色素瘤的防治研究提供技术支撑。     

小鼠肝炎病毒N基因的原核表达和免疫活性初步分析

目的对小鼠肝炎病毒（mouse hapetitis virus）A59毒株核蛋白（N）基因进行了克隆、表达和重组蛋白的免疫活性分析。方法根据GenBank公布的MHV-A59 N基因序列（AY700211）,设计了一对特异性引物,通过RT-PCR扩增出N基因的主要抗原片段NS,将目的片段纯化后与pGEM-T-easy载体连接得到重组质粒pTN,双酶切回收目的基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pGEX-NS,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行了诱导表达。对表达裂解物进行SDS-PAGE和Western-blotting验证。结果表达产物相对分子质量约56×103与预期相符;能与MHV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的NP（S）蛋白有良好的抗原性,为检测小鼠肝炎病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。     

hTNFRII-Fc融合基因的克隆及在CHO细胞中的表达

构建人肿瘤坏死因子受体II胞外区（TNFRII）和人免疫球蛋白（IgG1）Fc段的融合基因真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中表达融合蛋白hTNFRII-Fc。用全合成重叠延伸PCR方法克隆TNFRII胞外区的基因片段,再与（IgG1）Fc段拼接起来形成hTNFRII-Fc融合基因,经HindIII、EcoRI双酶切后插入至pEE14中构建pEE14-TNFRII-Fc真核表达载体,脂质体转染至CHO细胞中进行表达及鉴定。ELISA检测到转染hTNFRII-Fc基因的CHO细胞培养上清中含有hTNFRII-Fc蛋白,SDS-PAGE与Western-blot鉴定证实其为hTNFRII-Fc蛋白,为进一步研究该融合蛋白在CHO细胞稳定表达及应用于类风湿关节炎等自身免疫性疾病临床治疗奠定了一定的研究基础。     

人NANOGP8蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得抗人 NANOGP8基因的多克隆抗体,采用PCR法扩增了NANOGP8基因,经序列测定正确后,连接到pET-28a质粒上,将获得的重组质粒pET-28a-NANOGP8转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,在16℃和37℃下分别进行诱导表达,经SDS-PAGE检测发现融合蛋白以包涵体形式存在于37℃诱导表达的沉淀中,大小约为45kDa。对包涵体进行洗涤、溶解处理,经Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱进行纯化。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot免疫印记杂交检测,得到了单一条带。用获得的高纯度融合蛋白免疫新西兰兔,得到兔来源的抗人NANOGP8血清。对抗血清进行蛋白免疫印记杂交反应和酶联免疫吸附反应检测,结果显示成功制备了高滴度和特异性的兔抗人NANOGP8多克隆抗体,与市售抗人Nanog多克隆抗体相比,杂交更迅速,效果更明显。为进一步研究NANOGP8基因在肿瘤发生、发展中的作用奠定了基础。     

表皮生长因子受体胞外区在哺乳动物细胞HEK293T中的分泌表达和鉴定

目的:融合表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外功能区,为制备针对该分子的特异性抗体提供可用的靶标抗原。方法:通过PCR扩增EGFR胞外区基因,将其克隆入真核表达载体pABhFc中,重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,进行EGFR的瞬时分泌表达,纯化获得电泳纯级的分泌蛋白,并通过ELISA、Western印迹、Biacore3000系统对融合蛋白进行鉴定。结果:经测序证实扩增得到了正确的EGFR胞外区基因序列,SDS-PAGE初步确认获得了单、双体的EGFR胞外区,ELISA检测证实双体融合蛋白hFc-EGFR可与商业化的EGF特异性结合,Western印迹检测证实单体融合蛋白His-EGFR可与商业化抗体特异性结合;经Biacore3000蛋白分子相互作用系统测定,双体融合蛋白hFc-EGFR与商业化抗体爱必妥的亲和力达0.5 nmol/L。结论:利用哺乳动物细胞HEK293T分泌表达系统获得了结构正确的单、双体2种类型的EGFR胞外区融合蛋白纯品,将用于抗EGFR特异性抗体的筛选。     

检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白-ELISA的建立

将已构建成功的重组质粒pETN转化入Ecoli BL21(DE3)中,在最佳诱导条件下获得重组N蛋白。随后用His-Bind对表达产物进行纯化,对纯化效果及纯化产物的特异性分别用SDS-PAGE电泳及Western—blot试验检测。在此基础上,以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,对各种条件进行优化(如抗原的包被,作用时间及底物的选择),确定了判定标准。建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法。用此方法检测了200份血清样品,并与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果相比较,符合率达91％。     

Purification and characterization of human recombinant insulin-like growth factor binding protein 3 expressed in Chinese hamster ovary cells.

Recombinant human insulin-like growth factor binding protein 3 (hIGFBP-3) stably expressed in chinese hamster ovary cells (CHO cells) has been purified to homogeneity from serum-free culture media. The purified protein migrates as a doublet (45/43 kDa) upon SDS-PAGE. The purified recombinant hIGFBP-3 is fully active and binds one mole of IGF-I per mole of recombinant binding protein. When the transfected CHO cells are treated with tunicamycin a single 29 kDa hIGFBP-3 protein is observed. This expressed hIGFBP-3 protein maintains its ability to bind IGF-I. N-Glycanase treatment of the purified hIGFBP-3 protein results in a protein that migrates similar to E. coli-derived IGFBP-3 upon SDS-PAGE under reducing conditions (30 kDa). Carboxymethylation of hIGFBP-3 suggests that all 18 cysteines are involved in disulfide linkages. These results represent the first purification and characterization of recombinant hIGFBP-3 expressed in CHO cells.     

抗 CD20融合蛋白在 CHO 细胞中的表达及其纯化与鉴定

目的：构建CD20胞外区与Igβ胞外区和人IgG1 Fc融合基因的表达载体,并在CHO细胞中表达。方法与结果：根据已知的IgM的CH2区域和Igp胞外区序列,分别设计PCR引物并进行PCR扩增,然后用重叠PCR法扩增得到900bp的Igp-CH2序列,插入本实验室构建的pIRIS-EGFP-Fc载体,转化大肠杆菌,得到pIRIS-Igβ-CH2-Fc重组质粒,将其转染CHO-K1细胞,在G418抗性培养基中培养,荧光显微镜观察结合ELISA法筛选高表达细胞系,细胞系扩大培养后,通过亲和层析rProteinA柱纯化得到纯度融合蛋白,SDS-PAGE显示目的蛋白去糖基化后,相对分子质量约为42×10^3。结论：得到了Igβ-CH2-Fc重链抗体样分子,并鉴定为糖蛋白;须进一步对所得蛋白的生物学活性进行检测,验证其是否能够通过胞外区蛋白定位于B细胞淋巴瘤细胞表面对B淋巴瘤细胞进行杀伤。     

纤维连接蛋白细胞结合区功能多肽在杆状病毒表达系统中的表达与纯化

目的：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纤维连接蛋白（FN）细胞结合区功能多肽（CBD）,并对其进行纯化和鉴定。方法：经PCR获得人血浆FN-CBD基因,酶切后定向克隆到T载体上,经测序正确后插入pFastBacHTB载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞;用抗生素平板筛选重组杆粒,脂质体介导重组杆粒转染sf9昆虫细胞并进行蛋白表达;经Ni-NTA层析柱对重组多肽进行纯化,对纯化的多肽行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果：得到融合6个组氨酸残基的FN-CBD,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为36000,Western-blot表明该多肽能与FN的多克隆抗体结合。结论：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能成功表达出人血浆FN-CBD,且表达产物具有良好的免疫原性,为后续结构、功能研究奠定了基础。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.