激光捕获显微切割技术结合^18O标记定量蛋白质组技术在胃癌标志物筛查中的应用研究

建立一种更加精确地分离鉴定胃癌特异肿瘤标志物的定量蛋白质组学技术.首先采用激光捕获显微切割技术(LCM)纯化胃腺癌细胞及胃黏膜良性上皮细胞,将裂解的样本总蛋白经过1D SDS-PAGE预分离,然后采用17O/16O分别标记两种样本酶切后的多肽混合物.结合纳升级液相色谱(Nano-HPLC-MS/MS)定量地鉴定胃癌细胞和胃黏膜良性上皮细胞的差异表达蛋白.共筛选出78个差异表达蛋白,其中42个蛋白质在胃癌组织中表达上调,36个蛋白质下调.Western blot技术验证了其中几个差异蛋白(moesin,periostin,annexin A2,annexin A4)的表达,与蛋白质组学研究的结果一致.LOM技术结合18O稳定同位素标记的定量蛋白质组学技术,为研究胃癌发生机制、筛选胃癌的分子标志物提供了新的思路,亦为诸如胃癌等复杂体系蛋白质的分离鉴定提供了新的技术选择.     

p53、p63在SD大鼠隐睾中的表达

为探讨p53、p63在SD大鼠隐睾中的表达及其在隐睾所致生精障碍过程中的可能作用,本实验将30只健康雄性SD大鼠（40 dayold）随机分为隐睾组和假手术组,建立单侧隐睾模型。术后7d脱颈椎处死大鼠,留取各组大鼠双侧睾丸称湿重,常规组织学切片观察各组睾丸生精上皮形态,Western blot和免疫组织化学分别检测p53、p63蛋白表达的变化。     

热应激对大鼠睾丸iNOS和Bcl-2表达的影响

本实验通过建立大鼠单侧隐睾模型,研究热应激对睾丸诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase iNOS）和B细胞淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／leukemia-2,Bcl-2）基因表达的影响。42d龄SD雄性健康大鼠12只建立单侧隐睾作为热应激处理的模型,术后第7d处死大鼠留取双侧睾丸,常规组织学切片观察两侧睾丸生精上皮形态,     

激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌癌细胞和间质细胞的比较蛋白质组学研究

间质在肿瘤发生发展中的作用越来越受到重视。为寻找与鼻咽癌发生发展相关的特异性间质蛋白,首先采用激光捕获显微切割技术（1asercapture microdissection,LCM）纯化鼻咽癌癌细胞和间质细胞,再利用二维凝胶电泳（2-DE）分离癌细胞和间质细胞的总蛋白,通过PDQUEST分析两组差异表达的蛋白质点,采用质谱（MS）对差异表达的蛋白质进行鉴定,     

人NANOGP8蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得抗人 NANOGP8基因的多克隆抗体,采用PCR法扩增了NANOGP8基因,经序列测定正确后,连接到pET-28a质粒上,将获得的重组质粒pET-28a-NANOGP8转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,在16℃和37℃下分别进行诱导表达,经SDS-PAGE检测发现融合蛋白以包涵体形式存在于37℃诱导表达的沉淀中,大小约为45kDa。对包涵体进行洗涤、溶解处理,经Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱进行纯化。对纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot免疫印记杂交检测,得到了单一条带。用获得的高纯度融合蛋白免疫新西兰兔,得到兔来源的抗人NANOGP8血清。对抗血清进行蛋白免疫印记杂交反应和酶联免疫吸附反应检测,结果显示成功制备了高滴度和特异性的兔抗人NANOGP8多克隆抗体,与市售抗人Nanog多克隆抗体相比,杂交更迅速,效果更明显。为进一步研究NANOGP8基因在肿瘤发生、发展中的作用奠定了基础。     

激光捕获显微切割技术纯化的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞的比较蛋白质组学研究

为筛选鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)的分子标志物,采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection, LCM)分别从NPC组织和正常鼻咽上皮组织(normal nasopharyngal epithelial tissue, NNET)中切割纯化NPC细胞和正常鼻咽上皮细胞(normal nasopharyngal epithelial cells, NNEC),应用二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)分离LCM纯化细胞的蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾电离串联质谱(ESI-Q-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western blot检测差异蛋白cytokeratin 8 (CK8)在LCM纯化的NPC细胞和NNEC以及具有不同分化程度或转移潜能的4株NPC细胞中的表达,免疫组织化学检测CK8在63例NPC、28例NNET及20例颈淋巴结转移NPC组织中的表达水平.建立了LCM纯化的NPC细胞和NNEC的2-DE图谱,质谱鉴定了29个差异蛋白质,其中15个蛋白质只在NPC表达或表达明显增高,14个蛋白质在NPC中表达下调或缺失;Western blot结果显示,CK8的表达水平在NPC中较NNET明显下调,并与NPC细胞株的分化程度和转移潜能有关;免疫组织化学结果显示,CK8在NPC组织中的表达较NNET明显下调,在颈淋巴结转移NPC中的表达较原发NPC明显上调.研究结果提示,CK8与NPC分化及淋巴结转移相关,有望成为预测NPC转移和区别NPC分化程度的分子标志物.     

人胚心肌纤维中心房特殊颗粒的分布及心钠素的免疫组化研究

收集胚胎标本共24例（经临床证实孕妇无心血管疾病）,用透射电镜观察各胎龄心脏各部位心肌纤维中心特殊颗粒（ASG）分布及含量变化,同时结合免疫组织化学技术对心脏各部位心肌纤维内心钠素的表达进行研究。结果表明,胚第5周时,心肌纤维便有ASG出现,随着胎龄的增长,心房与心耳的颗粒数量逐渐增多。而心室的颗粒数量却逐渐减少,在同一胎龄,心房内的颗粒数量多于心室,心耳ASG多于心房,免疫组织化学的研究结果表明,胚第7周时,心房与心耳内可出现心钠素样免疫反应阳性的心肌细胞,其阳性反应的变化规律与ASG的变化规律一致。心室中未发现阳性反应。     

激光捕获显微切割技术结合18O标记定量蛋白质组技术在胃癌标志物筛查中的应用研究

建立一种更加精确地分离鉴定胃癌特异肿瘤标志物的定量蛋白质组学技术．首先采用激光捕获显微切割技术(LCM)纯化胃腺癌细胞及胃黏膜良性上皮细胞,将裂解的样本总蛋白经过1D SDS-PAGE预分离,然后采用¹⁸O/¹⁶O分别标记两种样本酶切后的多肽混合物．结合纳升级液相色谱(Nano-HPLC-MS/MS)定量地鉴定胃癌细胞和胃黏膜良性上皮细胞的差异表达蛋白．共筛选出78个差异表达蛋白,其中42个蛋白质在胃癌组织中表达上调,36个蛋白质下调．Western blot 技术验证了其中几个差异蛋白(moesin, periostin, annexin A2, annexin A4)的表达,与蛋白质组学研究的结果一致．LCM技术结合¹⁸O稳定同位素标记的定量蛋白质组学技术,为研究胃癌发生机制、筛选胃癌的分子标志物提供了新的思路,亦为诸如胃癌等复杂体系蛋白质的分离鉴定提供了新的技术选择．     

大鼠卵巢的生后发育

目的研究大鼠卵巢中卵泡生长发育的增龄性变化,为生殖生物学研究寻找动物模型.方法 用组织学方法,观察了0天～15月大鼠卵巢的形态结构.结果 0天见卵母细胞聚集呈团索状,未见卵泡;4天见大量原始卵泡;1周出现大量初级卵泡;2周见次级卵泡;3周次级卵泡数量增加,卵泡腔扩大;1月可见不同发育阶段的卵泡和闭锁卵泡;45天出现黄体;2月～5月,有大量黄体和生长卵泡;6月～8月,卵巢体积缩小,卵泡数量减少;12月萎缩,未见正常卵泡和黄体;15月,纤维化,可见囊泡.结论 大鼠从6月开始,生殖功能随月龄增长而进行性衰减,机体逐渐衰老.大鼠可用作研究女性生殖与衰老关系的动物模型.     

LCM纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽间质的定量蛋白质组学研究

间质在肿瘤发生发展中的作用越来越受到重视．为寻找与鼻咽癌( nasopharyngeal carcinoma,NPC )发生发展相关的特异性间质蛋白,采用激光捕获显微切割技术( laser capture microdissection,LCM )纯化鼻咽癌间质和正常鼻咽黏膜间质,荧光差异双向凝胶电泳( fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis 2-D,DIGE )结合质谱技术分离鉴定间质相关蛋白．Western blot及免疫组织化学技术验证了其中3个差异蛋白(CapG、L-plastin和S100A9),证实了2D-DIGE结果的可靠性．建立了LCM 纯化的鼻咽癌间质和正常鼻咽间质的荧光差异蛋白表达图谱,高通量筛选与肿瘤发生相关的间质蛋白,共得到34个有统计学意义的蛋白质点,质谱鉴定得到20个差异蛋白．研究结果提示：这些差异表达的蛋白质将有助于阐明鼻咽癌细胞和周围间质的关系．对间质蛋白功能的进一步研究,将有助于解析间质在肿瘤发生中的作用机制,并为从间质途径寻找肿瘤治疗靶标提供新思路．