用壳聚糖纳米磁性微球纯化血红细胞超氧化物歧化酶

本研究旨在用壳聚糖-聚丙烯酸纳米磁性微球纯化血红细胞超氧化物歧化酶。采用了接枝共聚法,以K2S2O8为引发剂,使壳聚糖(CTS)与聚丙烯酸(PAA)进行自由接枝共聚合成含有两性基团(-NH3,-COOH)的壳聚糖-聚丙烯酸纳米微球。化学共沉淀法制备Fe3O4磁流体,以戊二醛为交联剂,制备壳聚糖-聚丙烯酸纳米磁性微球。用傅里叶变换红外光谱仪对磁性微球结构进行检测。JEM-4000EX电镜技术对微球粒径,形貌进行表征。SOD试剂盒测定各步骤Cu-ZnSOD酶活性。结果表明,壳聚糖-聚丙烯酸纳米磁性微球有较好的粒径分布、磁响应性及蛋白吸附特性。纯化后酶比活性达6 727 U/mg,产品得率21.1%,活性回收85.7%。壳聚糖-聚丙烯酸纳米磁性微球经血液纯化血红细胞SOD具有可再生性、易操作性,其纯化效果取决于金属Cu2+的螯合程度。     

不同佐剂条件下Aβ多肽B细胞表位疫苗诱导产生抗体的免疫反应特性分析

目的:研究阿尔茨海默病β淀粉样肽(Aβ)B细胞表位疫苗2Aβ1-15-PADRE(Aβ-T)诱导产生抗体的免疫反应特性,并探讨不同佐剂对该疫苗免疫反应效果的影响。方法:合成了含2个Aβ42的 B细胞表位—Aβ1-15及1个辅助T细胞表位—PADRE的多肽2Aβ1-15-PADRE。采用Al(OH)₃佐剂,弗氏佐剂,Abisco佐剂,MF59佐剂分别与多肽疫苗联合免疫小鼠,并另设3个对照组:无佐剂多肽免疫组(Mock),PBS免疫组(PBS),未免疫组(Native)。结果:5组多肽免疫组小鼠均产生了针对Aβ的特异性抗体,无佐剂多肽免疫组的IgG抗体滴度最低,Al(OH)₃佐剂组,MF59佐剂组,Abisco佐剂组小鼠IgG抗体滴度较高,弗氏佐剂组IgG抗体滴度最高。斑点杂交实验结果显示5组小鼠免疫后血清与Aβ42单体反应较弱,与寡聚体反应最明显,与纤维状Aβ42几乎不反应。结论:4种佐剂均能提高多肽疫苗的免疫反应,产生高水平抗Aβ的特异性抗体。5组免疫小鼠产生的抗体均与Aβ寡聚体反应较强,与纤维状Aβ42反应较弱,表明该多肽疫苗具有良好的应用前景。     

GM-CSF和IL-4增强Aβ表位DNA疫苗的免疫原性研究

目的:探究和评价粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素4(IL-4)作为β淀粉样蛋白(Aβ)表位DNA疫苗的分子佐剂,增强DNA疫苗体液和细胞免疫反应的水平。方法:阿尔茨海默病DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T分别与重组DNA分子佐剂p VAX1-S-IL-4和p VAX1-S-GM-CSF联合免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性。结果:分子佐剂IL-4组相比单独的DNA表位疫苗p VAX1-6Aβ15-T组抗体水平具有一定程度的提高;GM-CSF能明显提高DNA疫苗Aβ特异的抗体水平和泛DR辅助T细胞表位(PADRE)特异的细胞免疫反应,4次免疫后其抗体滴度提高了4倍。结论:GM-CSF佐剂能够有效地用于今后阿尔茨海默病DNA表位疫苗的研究中。     

猪血超氧化物歧化酶分离纯化工艺改进及其抗氧化活性研究

以新鲜猪血为原料,首次利用改进的新工艺提取分离超氧化物歧化酶,经过溶血,热变,丙酮沉淀,超滤浓缩,SephadexG-75凝胶过滤层析和DEAE-sepharose-fast flow离子交换层析纯化,冷冻干燥等步骤,得到高纯度酶,并对酶的相关性能进行研究。试验结果显示产品粗酶活性在3 000 U/mg左右,分别经SephadexG-75和DEAE-sepharose-fast flow层析纯化后,酶活分别达到5 585 U/mg和6 148 U/mg产品得率分别为13.4%和10.32%,SDS-PAGE凝胶电泳显示为单一条带达到电泳纯,其分子量在31 kD附近,其临苯三酚抗氧化活性明显。     

人源蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2基因克隆与原核表达

目的:构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:以人脑组织mRNA为模板,通过RT-PCR扩增出目标cDNA,构建蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2-pEASY-E1重组质粒。将重组质粒转化进E.coli TOP10感受态细胞中,通过菌落PCR和测序进行阳性克隆的筛选和验证,将正确的质粒转化E.coli Transetta感受态细胞中,通过SDS-PAGE和western-blot进行蛋白检测和验证,酶促动力学分析SHP-2可溶性蛋白的活性。结果:成功克隆SHP-2功能域,构建SHP-2-pEASY-E1原核表达载体,完成可溶性蛋白的表达;酶促动力学分析结果为:米氏常数Km=0.97mmol/L,Vmax为13.57mmol/L/s。结论:本研究成功构建SHP-2的原核表达载体,重组表达的SHP-2蛋白具有较高的磷酸酶活性。     

脉络宁对SH-SY5Y细胞氧糖剥夺再恢复损伤的保护作用及其机制研究

目的：研究脉络宁注射液对SH—SY5Y细胞氧糖剥夺／再复氧糖（OGI）／R）损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法：体外培养SH-SY5Y细胞,将细胞随机分为正常组、氧糖剥夺模型组和脉络宁组（1．0mL·L^-1）,建立体外OGD／R细胞模型。倒置显微镜观察细胞形态;MTT法测定细胞存活率;测定乳酸脱氢酶（LDH）漏出量;Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax蛋白表达的变化。结果：与模型组相比,脉络宁能减轻OGD／R引起的SH-SY5Y细胞的损伤,明显提高细胞存活率（P〈0．05）,减少LDH的释放量（P〈0．05）,有效抑制Bax蛋白的表达（P〈0．05）,上调Bcl-2的表达（P〈0．05）。结论：脉络宁注射液对OGD／R引起的SH-sY5Y细胞损伤有保护作用,其机制可能与影响凋亡相关基因Bcl-2、Bax的表达有关。     

紫花苜蓿胚状体形成中的二次诱导

1 植物名称 紫花苜蓿（Medicago sativa L．）。     

用低聚PAAS热沉淀法提取血液超氧化物歧化酶

目的:通过对传统工艺的改进,探索简便快速的SOD提取分离方法,以适合大量制备的需要.方法:使用低分子量聚丙烯酸钠和氯化铜溶液作为分散剂和酶激活剂,经过溶血、热变、超滤浓缩、冷冻干燥等步骤,从猪血液中分离SOD.结果:新工艺分离出SOD的活力达到3000u/mg以上,达到有机溶剂提取和高浓度盐析提取得到的活力水平,经SephadexG-75纯化后在SDS-PAGE上显示单一条带.结论:低分子量聚丙烯酸钠和氯化铜溶液可作为SOD提取的分散剂和酶激活剂,对大量制备该产品具有一定的参考价值.     

表皮生长因子受体胞外区在哺乳动物细胞HEK293T中的分泌表达和鉴定

目的:融合表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外功能区,为制备针对该分子的特异性抗体提供可用的靶标抗原。方法:通过PCR扩增EGFR胞外区基因,将其克隆入真核表达载体pABhFc中,重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,进行EGFR的瞬时分泌表达,纯化获得电泳纯级的分泌蛋白,并通过ELISA、Western印迹、Biacore3000系统对融合蛋白进行鉴定。结果:经测序证实扩增得到了正确的EGFR胞外区基因序列,SDS-PAGE初步确认获得了单、双体的EGFR胞外区,ELISA检测证实双体融合蛋白hFc-EGFR可与商业化的EGF特异性结合,Western印迹检测证实单体融合蛋白His-EGFR可与商业化抗体特异性结合;经Biacore3000蛋白分子相互作用系统测定,双体融合蛋白hFc-EGFR与商业化抗体爱必妥的亲和力达0.5 nmol/L。结论:利用哺乳动物细胞HEK293T分泌表达系统获得了结构正确的单、双体2种类型的EGFR胞外区融合蛋白纯品,将用于抗EGFR特异性抗体的筛选。